Schritte, die an der Polymerasekettenreaktion in der DNA-Sequenz beteiligt sind

Einige der Hauptschritte, die an der Polymerasekettenreaktion in der DNA-Sequenz beteiligt sind, sind: 1. Schritt 1: Denaturierung durch Wärme 2. Schritt 2: Anlagerung des Primers an die Zielsequenz 3. Schritt 3: Verlängerung 4. Schritt 4: Ende des ersten PGR-Zyklus .

Die Polymerase-Kettenreaktion (PGR) amplifiziert ein einzelnes DNA-Stück über mehrere Größenordnungen (siehe Abbildung 6.2). Es ist die Erstellung von Tausenden bis Millionen Kopien einer bestimmten DNA-Sequenz.

1. Schritt 1: Denaturierung durch Wärme:

Wärme ist normalerweise mehr als 90 Grad Celsius, wenn doppelsträngige DNA in zwei Einzelstränge getrennt wird. Dieser Vorgang wird als "Denaturierung" bezeichnet. Die Wasserstoffbrückenbindungen, die die Basen miteinander verbinden, sind schwach, daher ist eine Denaturierung möglich. Die Wasserstoffbrückenbindungen brechen bei hohen Temperaturen, während die Bindungen zwischen Desoxyribose und Phosphaten erhalten bleiben, da diese stärker sind.

2. Schritt 2: Tempern der Primer an die Zielsequenz:

Das ultimative Ziel der PGR ist die Replikation einer Zielsequenz von etwa 100 bis 600 Basenpaaren, die für den untersuchten Organismus einzigartig ist. Das Targeting der Sequenz wird durch die Verwendung von Primern erreicht. Primer markieren die Enden der Zielsequenz.

AMPLICOR® Test-Primer sind kurze, synthetische Sequenzen aus einsträngiger DNA, die typischerweise aus 20 bis 30 Basen bestehen, wobei das Biotin-markierte 5'-Ende den Nachweis erleichtert. Für die Zielregion des Organismus sind sie spezifisch. PGR hat zwei Primer, einen für jeden der komplementären Einzel-DNA-Stränge, der während der Denaturierung erzeugt wurde, und einzelne DNA-Stränge, die während der Denaturierung erzeugt wurden.

Der Anfang der interessierenden DNA-Zielsequenz wird durch die Primer markiert, die an die komplementäre Sequenz anlagern (binden). Das Tempern findet normalerweise zwischen 40 ° C und 65 ° C statt, abhängig von der Länge und der Basensequenz der Primer.

3. Schritt 3: Erweiterung:

Die Temperatur wird auf ungefähr 72 ° C erhöht, nachdem die Primer an die komplementären DNA-Sequenzen angelagert wurden. Das Enzym Taq-DNA-Polymerase wird auch verwendet, um die DNA-Stränge zu replizieren. Taq DNA-Polymerase ist eine rekombinante thermostabile DNA-Polymerase aus dem Organismus Thermus Aquatics, die im Gegensatz zu normalen Polymerase-Enzymen bei hohen Temperaturen aktiv ist.

Das Syntheseverfahren synthetisiert neue doppelsträngige DNA-Moleküle, die beide identisch mit der ursprünglichen doppelsträngigen Ziel-DNA-Region sind, indem sie die Bindung und Verbindung der in Lösung freien komplementären Nukleotide (dNTPs) erleichtern. Die Verlängerung beginnt immer am 3'-Ende des Primers, so dass aus jedem der beiden Einzelstränge ein Doppelstrang entsteht. Taq-DNA-Polymerase synthetisiert ausschließlich in der Richtung von 5 'nach 3'.

4. Schritt 4: Ende des ersten PGR-Zyklus:

Am Ende des ersten PGR-Zyklus gibt es jetzt zwei neue DNA-Stränge, die mit dem ursprünglichen Ziel identisch sind. Die neu gebildeten Stränge haben einen Anfang, der durch das 5'-Ende des Primers genau definiert ist, das 3'-Ende ist jedoch nicht genau definiert.

Der aus einem solchen Templat synthetisierte DNA-Strang hat dann eine genau definierte Länge, die an beiden Enden durch das 5'-Ende jedes der beiden Primer begrenzt ist. Diese DNA-Stränge sind als AMPLIGON bekannt. DNA-Stränge, die der Zielsequenz entsprechen. Bereits nach wenigen Zyklen sind die Sequenzen mit variabler Länge in viel größerer Anzahl vorhanden. Die von den beiden Primern flankierte oder definierte Sequenz ist der Abschnitt, der amplifiziert wird.