Western-Blotting von Proteinen
Western-Blotting von Proteinen!
Proteine werden durch Inkubation mit einem ionischen Detergens (SDS: Natriumdodecylsulfat) bei 100 ° C denaturiert.
SDS beschichtet alle Proteine gleichmäßig und macht die Oberflächenladung der Proteine negativ.
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Das denaturierte Protein wird anschließend in Polyacrylamidgel elektrophoretisiert. Die Proteine werden als unterschiedliche Banden in Abhängigkeit von ihrem Molekulargewicht getrennt.
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Die separierten Proteine werden elektrophoretisch auf ein Filterpapier (Nylon oder Nitrocellulose) übertragen.
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Das Filterpapier wird dann mit Antiseren gegen die Proteine inkubiert. Die Antikörper binden an ihre entsprechenden Proteinantigene auf dem Filterpapier und bilden Antigen-Antikörper-Komplexe.
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Das Filterpapier wird gewaschen, um ungebundene Serumkomponenten zu entfernen.
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Enzymmarkiertes Anti-Immunglobulin (bekannt als Konjugat) wird zu dem Filterpapier gegeben und inkubiert.
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Das Konjugat bindet an den Antikörper im Antigen-Antikörper-Komplex im Filterpapier.
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Das Filterpapier wird gewaschen, um ungebundenes Konjugat zu entfernen, und das Substrat wird zugegeben und inkubiert.
ich. Farbige Banden entwickeln sich an Stellen, an denen Antigen-Antikörper-Komplexe vorhanden sind.
iii. Die Nichtentwicklung der Bande legt nahe, dass der entsprechende Antikörper gegen das Antigen im Testserum fehlt.
Die mit Antigenen getränkten Filterpapiere können längere Zeit gelagert werden.
Der Western-Blot-Test wird häufig zum Nachweis von Hepatitis-C-Virus-Antikörpern und als Bestätigungstest zum Nachweis von Antikörpern gegen das humane Immundefizienzvirus (HIV) eingesetzt.
Handelsfirmen imprägnieren Filterpapiere mit getrennten HIV-Antigenen und liefern diese an die Labore. Im Labor wird dem Filterpapier Patientenserum zugesetzt und verarbeitet, um das Vorhandensein von HIV-spezifischen Antikörpern im Serum nachzuweisen.
Radioimmuntest:
Der Radioimmunoassay (RIA) wurde zuerst von Rosalin Yalow und Berson (1959) entwickelt. Zahlreiche Variationen der Methode wurden eingeführt. Es gibt zwei Haupt-RIA-Techniken: Konkurrenzfähige und nicht wettbewerbsfähige RIA.
Verschiedene Radioisotope werden als Markierungen verwendet (Tabelle 27.4) und die radioaktiven Emissionen werden in Zählungen pro Minute (CPM) unter Verwendung eines Szintillationszählers gemessen. Das bekannteste Etikett, 125 I, benötigt eine kürzere Zeit für die Signalzählung, ist jedoch aufgrund seiner kurzen Halbwertzeit nur begrenzt haltbar. Tritium ( 3 H) -Radiisotop erfordert eine längere Zeit zum Zählen und daher ist die Gesamtassayzeit erhöht.
Die Vorteile von RIA sind:
ich. Präzision und Qualität
ii. Die Isotopenkonjugation ist einfach
iii. Signalerkennung ohne Optimierung
Tabelle 27.4: Eigenschaften von Radioisotopen im Radioimmunoassay:
Isotop | Halbes Leben | Art des Verfalls | Spezifische Aktivität (mCi / µmol) |
125 ich | 60 Tage | γ | 2200 |
131 ich | 8, 1 Tage | Β-, γ | 16.100 |
3 h | 12, 3 Jahre | β- | 29 |
14 C | 5760 Jahre | β- | 6062 |
32 p | 14, 3 Tage | β- | 9120 |
RIA hat jedoch die folgenden Nachteile
ich. Kurze Halbwertszeit der Reagenzien
ii. Gefahren der Radioaktivität.
