Nützliche Hinweise zu Lymphozytenaktivierungsassays
Die funktionellen Fähigkeiten von Lymphozyten als Reaktion auf Antigene oder Mitogene werden durch Lymphozytenaktivierungsassays bestimmt.
Daher sind Lymphozytenaktivierungsassays geeigneter zur Beurteilung der Immunkompetenz des Individuums als eine einfache Zählung von Lymphozyten.
Es gibt zwei Arten von Lymphozytenaktivierungsassays:
ich. Nachweis von Aktivierungsmarkern auf der Lymphozytenoberfläche.
ii. Beurteilung der Proliferationsfähigkeit von Lymphozyten nach T-Zellstimulation.
Die am häufigsten verwendeten T-Zellstimuli zur Beurteilung der T-Lymphozytenproliferation sind:
ich. Lektine [wie Phytohemagglutinin (PHA) und Concanavalin A (ConA)
ii. Bakterielle Toxine, die als Superantigene wirken
iii. Chemische Verbindungen [wie Phorbalmyristatacetat (PMA), Calciumionophore
iv. Zytokine
v. mAbs an Oberflächenrezeptoren (insbesondere CD3-Moleküle an T-Zellen)
Die Aktivierung von B-Zellen wird induziert durch:
ich. Pokeweed Mitogen (PWM). PWM aktiviert auch T-Zellen
ii. Superantigene
iii. Lipopolysaccharide
iv. mAbs, die Slgs auf der B-Zelloberfläche vernetzen.
ein. Gereinigte Lymphozyten werden in Mikrotitertöpfen mit 96 Vertiefungen kultiviert und mit Antigen oder Mitogen stimuliert (normalerweise 48 Stunden lang).
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Tritiiertes Thymidin ( 3 H-Tdr) wird zu den Vertiefungen gegeben und inkubiert
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Der Inhalt der Vertiefungen wird durch Filter gesaugt und filtriert, und die Menge an 3 H Tdr im Filterpapier wird gemessen. Der Einbau von 3 H-Tdr in chromosomale DNA spiegelt die Zellproliferation wider.
b. Es gibt nicht radioaktive Assays, um die Proliferation von Zellen zu bestimmen. Diese Assays verwenden fluoreszierende Farbstoffe, die in DNA eingebaut sind, oder Farbstoffe, die oxidative Atmung messen, wie MTT.
c. Bromodeoxyuridin (BrdU) wird in die DNA von stark replizierenden Zellen eingebaut und kann daher zur Beurteilung der Zellproliferation verwendet werden. Das in Zellen eingebaute BrdU wird durch Verwendung von mAbs gegen BrdU und Durchflusszytometrie nachgewiesen (wie der Nachweis intrazellulärer Antigene durch Durchflusszytometrie).
BrdU kann auch Krebspatienten in vivo verabreicht werden, und später kann der Tumor reseziert werden und die Tumorzellen können auf den Einbau von BrdU untersucht werden. Dieser Assay liefert eine Vorstellung von der proliferativen Fraktion von Tumorzellen in einem Patienten.
d. Die Aktivierung zytotoxischer T-Zellen wird durch 51 Chrom-Freisetzungsassay getestet:
Zielzellen sind mit radioaktivem Chrom ( 51 Cr) markiert, das an intrazelluläre Proteine der Zielzellen bindet.
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Die markierten Zielzellen werden mit zytotoxischen T-Zellen inkubiert.
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Zielzellenlyse durch die zytolytischen T-Zellen führt zur Freisetzung des 51 Cr.
Die Zellen werden zentrifugiert und das freigesetzte 51 Cr im Überstand wird gemessen. Die Menge an freigesetztem 51 Cr ist proportional zur Lyse von Zellen.
