Immunodiffusion von Antigen oder Antikörpern

Immunodiffusion von Antigen oder Antikörpern!

Immundiffusion bezieht sich auf die Bewegung von Antigen oder Antikörper oder sowohl von Antigen- als auch Antikörpermolekülen in einem Trägermedium durch Diffusion.

Antigen und Antikörper verbinden sich miteinander und bilden einen unlöslichen Immunpräzipitat, der mit bloßem Auge als Präzipitinbande oder -linie sichtbar ist. J. Oudin beschrieb ein System der einmaligen Diffusion von Antigen und Antikörper in mit Agar gefüllten Röhrchen.

Bald beschrieb Ouchterlony die doppelte Diffusion in Agar, auf Dias geschichtet. Bewegung wird auch als linear oder radial beschrieben. Die Immunodiffusionsverfahren werden zur qualitativen und quantitativen Analyse von Serumproteinen verwendet. Sensitivere und spezifischere Methoden wie der ELISA (Enzyme Linked Immunoabsorbent Assay) und der Radio-Immunoassay (RIA) haben die Immunodiffusionsmethoden fast ersetzt.

Einzelne Immundiffusion:

Entweder Antigen oder Antikörper bleibt fixiert und der andere Reaktant bewegt sich (Diffusionstechnik von Oudin).

Doppelte Immunodiffusion:

Sowohl Antigen als auch Antikörper können sich aufeinander zu bewegen. (Ouchterlony-Technik).

Geschmolzener Agar wird auf einen Objektträger oder Petrischale gegossen und erstarren gelassen. Zwei kleine Vertiefungen im Abstand von wenigen Millimetern werden ausgestanzt. Antigen und entsprechende Antikörperlösungen werden in gegenüberliegenden Vertiefungen abgelegt. Der Objektträger / Petrischale wird dann 18 bis 24 Stunden in einer feuchten Kammer gehalten. Das Antigen und der Antikörper bewegen sich durch den Agar und verbinden sich, um einen Antigen-Antikörper-Komplex zu bilden. Der Antigen-Antikörper-Komplex ist als Präzipitationslinie sichtbar.

Die doppelte Diffusion wird auch durchgeführt, indem Antigen- und Antikörper-Wells zu Vergleichszwecken in verschiedenen Winkeln angeordnet werden. Die drei Muster dieser Reaktionen sind in Abbildung 27.2 dargestellt.

ich. Reaktion der Identität:

Antigene in zwei Vertiefungen sind identisch (Agl und Ag2). Die Reaktion mit dem Antikörper führt also zu genau ähnlichen Präzipitallinien. Die Ausscheidungslinien kreuzen sich nicht, sondern bilden eine durchgehende Linie. Die Fusion der beiden Ausfällungslinien zeigt an, dass der Antikörper mit Epitopen reagiert, die üblicherweise auf den beiden Antigenen vorhanden sind.

ii. Reaktion auf Nichtidentität:

Zwei nicht identische Antigene (Agl und Ag3) befinden sich in den Antigenvertiefungen, während die Antikörpervertiefung Antikörper gegen beide Antigene aufweist. Die beiden gebildeten Antigen-Antikörper-Präzipitinlinien unterscheiden sich voneinander. Daher kreuzen sich die beiden Ausscheidungslinien vollständig (kreuzen sich).

iii. Reaktion der partiellen Identität:

Die antigenen Determinanten in den Antigenen zweier Wells sind teilweise geteilt (Agl und Agla). Daher reagiert der Antikörper sowohl mit den Antigenen als auch mit Linien, die kein vollständiges Kreuz bilden. Die Niederschlagslinie kreuzt sich nur in eine Richtung. Die verlängerte Ausfällungslinie wird als Sporn bezeichnet. Der Sporn zeigt an, dass der Antikörper auch ein zusätzliches Epitop ausfällt, das in einem der Antigene nicht vorhanden ist.

Die doppelte Immundiffusion kann auch zur semi-quantitativen Analyse von Antigen oder Antikörper verwendet werden (Abb. 27.3):

Abb. 27.3:

Doppelte Immundiffusion zur semi-quantitativen Antigenanalyse. Der Antikörper wird in die zentrale Vertiefung gegeben und das Antigen wird in verschiedenen Konzentrationen in die peripheren Vertiefungen gebracht

ich. Quantifizierung des Antigens

Das Antigen X wird seriell verdünnt und in die Vertiefungen platziert, die eine zentrale Vertiefung umgeben, in die der Anti-X-Antikörper eingebracht wird. Das Antigen und der Antikörper diffundieren aus den Vertiefungen und reagieren miteinander, was zur Bildung von Präzipitinlinien zwischen den Antigen- und Antikörpervertiefungen führt. Die Menge an Antigen-Antikörper-Präzipitat nimmt mit abnehmenden Antigenmengen in den verschiedenen Vertiefungen ab. Daher nimmt die Dicke der Ausfällungslinien ab, wenn die Antigenkonzentrationen abnehmen.

ii. Quantifizierung des Antikörpers:

Es wird ein der Quantifizierung des Antigens ähnliches Verfahren verwendet, mit der Ausnahme, dass die Position des Antigens und des Antikörpers geändert wird. Das Antigen wird in die zentrale Vertiefung gegeben, und Antikörper mit unterschiedlichen Verdünnungen werden in die äußeren Vertiefungen gegeben.

Einzelne radiale Immunodiffusion:

Mancini führte diese neuartige Technik zur genauen Quantifizierung von Antigenen ein. Der Antikörper wird mit geschmolzenem Agar gemischt und in eine Petrischale gegossen. Nach der Verfestigung des Agars werden die Vertiefungen geschnitten und mit unterschiedlichen Antigenkonzentrationen gefüllt (Abb. 27.4).

Das Antigen diffundiert aus der Vertiefung und bildet innerhalb von 48 bis 72 Stunden den Niederschlag des Antigen-Antikörper-Komplexes. Der Niederschlag wird als weiße Kreislinie um jede Vertiefung gesehen. Der Durchmesser des Kreisrings ist direkt proportional zur Antigenkonzentration (dh mehr die Antigenkonzentration, der Durchmesser des Niederschlags ist größer).

Eine Standardkurve kann in einem Diagrammblatt dargestellt werden, indem die bekannten Antigenkonzentrationen in der X-Achse und die Durchmesser in der Y-Achse aufgetragen werden. Das Testantigen, dessen Konzentration unbekannt ist, kann durch Interpolation der Standardkurve mit dem Durchmesser des durch das Testantigen gebildeten Niederschlags bestimmt werden.

Die Empfindlichkeit dieses Verfahrens beträgt 1 bis 3 ug / ml Antigen. Dieses Verfahren wird verwendet, um die Konzentrationen von IgG, IgM oder IgA zu quantifizieren (durch Einbau von Anti-IgG-, Anti-IgM- oder Anti-IgA-Antiseren in das Agar).