ELISA-Verfahren (Enzyme-Linked Immnoabsorbent Assay) zum Nachweis von Antigen

ELISA-Methoden zum Nachweis von Antigen!

Das Enzym-gebundene Immnoabsorbens-Verfahren kann verwendet werden, um entweder Antigen oder Antikörper nachzuweisen. Die ELISA-Methode hat viele Vorteile gegenüber anderen Methoden (Tabelle 27.2).

Die ELISA-Methode ist 10- bis 1000-fach empfindlicher als die älteren Methoden wie Agglutination und Immunelektrophorese. Es gibt verschiedene Modifikationen von ELISA, von denen einige hier beschrieben werden.

Tabelle 27.2: Vorteile von Enzymimmuntests

1. Der Amplifikationseffekt von Enzymen führt zur Entwicklung empfindlicherer Assays

2. Reagenzien haben eine lange Haltbarkeit und sind vergleichsweise günstig

3. Eine Vielzahl von Assay-Konfigurationen kann entwickelt werden

4. Ausrüstung ist weniger kostspielig und allgemein verfügbar

5. Keine Strahlengefährdung

6. Kann auch in kleinen Laboren durchgeführt werden

ELISA-Assay-Antikörper:

Bekanntes Antigen wird auf Vertiefungen einer Mikroliterplatte aufgetragen (kleine Plastikplatte, die zur Maximierung der Proteinbindung behandelt wurde; enthält 96 Vertiefungen mit einem Volumen von 200 µl).

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Menschliches Testserum wird in die Vertiefung gegeben und inkubiert.

ich. Wenn das Serum Antikörper gegen das beschichtete Antigen enthält, binden die Antikörper an die Antigene.

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Die Vertiefungen werden gewaschen, um ungebundene Serumkomponenten zu entfernen.

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Enzym konjugiertes Anti-Human-Immunglobulin (bekannt als Konjugat) wird zu den Vertiefungen gegeben und inkubiert.

ii. Das Konjugat bindet an die Antigen-gebundenen Antikörper in der Vertiefung.

iii. Wenn das Testserum keine Antikörper gegen das Antigen enthält, verbleibt das Konjugat in der Lösung.

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Die Vertiefungen werden gewaschen, um ungebundenes Konjugat zu entfernen.

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Ein geeignetes Substrat wird in die Vertiefungen gegeben und inkubiert.

iv. Das Enzym des Konjugats im Antigen-Antikörper-Konjugatkomplex wirkt auf das Substrat und spaltet das Substrat, um ein farbiges Produkt zu erzeugen. Die Farbentwicklung zeigt an, dass im Testserum Antikörper vorhanden sind, die für das auf den Wells beschichtete Antigen spezifisch sind.

v. Nichtentwicklung der Farbe zeigt an, dass das Testserum keine Antikörper gegen das auf den Vertiefungen beschichtete Antigen aufweist.

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Eine Stopplösung (üblicherweise IN Schwefelsäure) wird zugegeben, um die Reaktion zu stoppen. Dann wird die Platte in einem ELISA-Lesegerät aufbewahrt und die optische Dichte (OD) der Wells gemessen. Die OD entspricht der Antikörpermenge im Testserum.

Durch Verwendung bekannter Antikörperkonzentrationen kann ein Graph erstellt werden. Die Antikörperkonzentrationen sind auf der X-Achse und die entsprechenden ODs auf der Y-Achse aufgetragen und eine Kurve ist gezeichnet. Durch Interpolation des OD-Wertes des Testserums wird die Konzentration von Antikörpern in einem Testserum bestimmt.

ELISA zur Bestimmung des Antigens:

Ein bekannter monoklonaler Antikörper (als primärer Antikörper bezeichnet) gegen ein Antigen wird auf die Mikrotiterplatten aufgebracht.

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Die Probe, die das Antigen enthalten soll, wird in die Vertiefung gegeben und inkubiert.

ich. Wenn die Probe das entsprechende Antigen enthält, bindet das Antigen an den Antikörper in der Vertiefung und bildet einen Antigen-Antikörper-Komplex.

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Die Vertiefungen werden gewaschen, um ungebundenes Material zu entfernen.

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Ein bekannter enzymkonjugierter mAb (als Konjugat bezeichnet) gegen das Antigen wird in die Vertiefungen gegeben und die Platte wird inkubiert.

ich. Wenn die Vertiefung einen Antigen-Antikörper-Komplex enthält, bindet das Konjugat an das Antigen im Komplex.

ii. Wenn kein Antigen-Antikörper-Komplex vorhanden ist, bleibt das Konjugat in Lösung.

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Die Wells werden gewaschen, um das ungebundene Konjugat zu entfernen. Ein geeignetes Substrat wird zugegeben und inkubiert.

ich. Wenn sich in der Vertiefung Konjugat befindet, spaltet das Enzym des Konjugats das Substrat und erzeugt ein farbiges Produkt.

iii. Das Fehlen einer Farbentwicklung zeigt an, dass sich kein Antigen in der Probe befindet (gegen den auf den Vertiefungen beschichteten Antikörper).

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Eine Stopplösung wird zugegeben, um die Reaktion zu stoppen. ODs der einzelnen Wells werden im ELISA-Reader gelesen. Wie zuvor erläutert, wird ein Diagramm (bestehend aus verschiedenen Antigenkonzentrationen auf der X-Achse und den entsprechenden ODs auf der Y-Achse) erstellt und die Kurve gezeichnet. Die Konzentration des Antigens in der Testprobe wird durch Interpolation seiner OD bestimmt.

Antikörper-Capture-ELISA-Methode:

Vertiefungen der Mikrotiterplatte sind mit Anti-Human-IgM-Antikörpern beschichtet.

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Patientenserum wird zugegeben und inkubiert. Die IgM-Antikörper im Serum binden an die Anti-Human-IgM-Antikörper in den Wells.

Die Vertiefungen werden gewaschen und dann wird ein bekanntes Antigen zugegeben und inkubiert.

ich. Wenn IgM-Antikörper gegen das Antigen in der Vertiefung vorhanden sind, bindet das Antigen an den IgM-Antikörper und verbleibt in der Vertiefung.

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Die Vertiefungen werden gewaschen, um ungebundenes Antigen zu entfernen

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Ein mit dem Antigen konjugierter enzymatischer mAb wird zugegeben und inkubiert.

ich. Wenn Antigen in der Vertiefung vorhanden ist (Anti-IgM-IgM-Antigen-Komplex), bindet das Konjugat an das Antigen.

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Die Vertiefungen werden gewaschen, um ungebundenes Konjugat zu entfernen, und das Substrat wird zugegeben.

ich. Die Farbentwicklung zeigt an, dass IgM-Antikörper gegen das Antigen im Patientenserum vorhanden sind.

ii. Nichtentwicklung der Farbe zeigt an, dass das Patientenserum keine IgM-Antikörper gegen das Antigen enthält.

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Die Stopplösung wird hinzugefügt und die ODs der Wells werden einzeln im ELISA-Reader gemessen. Die Menge der IgM-Antikörper gegen das Antigen kann durch Zeichnen eines Diagramms wie zuvor beschrieben bestimmt werden.

Ein ähnliches Verfahren kann zum Nachweis von IgG-Antikörpern gegen ein Antigen verwendet werden.

Die bei den ELISA-Techniken üblicherweise verwendeten Enzyme sind Meerrettichperoxidase und alkalische Phosphatase (Tabelle 27.3). Diese Enzyme sind kovalent an mAbs gekoppelt. Eine Vielzahl von Substraten wird von diesen Enzymen beeinflusst, um farbige Produkte herzustellen. Da der letzte Schritt des ELISA-Verfahrens enzymatisch ist, ist das ELISA-Verfahren äußerst empfindlich (dh sehr geringe Antigen- oder Antikörperkonzentrationen sind nachweisbar).

Die Empfindlichkeit von ELISA-Assays wird durch die Verwendung zusätzlicher Reagenzien (z. B. Biotin / Avidin-Immunoassay) erhöht. In letzter Zeit hat die Verwendung von Meerrettichperoxidasesubstraten, die chemilumineszierende Produkte erzeugen, die Empfindlichkeit weiter erhöht. Die Messung der Reaktionsgeschwindigkeit und nicht das Ausmaß der Reaktion zu einem einzigen festgelegten Zeitpunkt liefert genauere quantitative ELISA-Ergebnisse.

Tabelle 27.3: Eigenschaften von Enzymen, die in Enzymimmuntests verwendet werden:

Biotin-Avidin-verstärkter ELISA:

Anstatt den mAb mit einem Enzym zu markieren, kann der MAb mit Biotin (Vitamin B ₁₂ ) markiert werden.

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Dann wird enzymmarkiertes Avidin (eine Proteinkomponente des Eiweißes) zugegeben.

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Avidin bindet mit sehr hoher Empfindlichkeit und Affinität an Biotin. Anschließend wird das Substrat hinzugefügt. Der Enzymkomplex (im mAb-Biotin-Avidin-Enzym) -Komplex wirkt auf das Substrat und erzeugt ein farbiges Produkt.

Biotin-Avidin-Verstärkung wird auch in Immunfluoreszenz-Assays verwendet.

Mikroteilchen-Enzym-Immunoassays:

Anstatt die Vertiefungen der Mikrotiterplatte mit Antigenen oder Antikörpern zu beschichten, werden kleine Perlen (Durchmesser 1 mm) mit Antigen oder Antikörper beschichtet und ELISA-Assays werden durchgeführt. Die Mikropartikel bieten eine größere Oberfläche für die Antigen- oder Antikörperbeschichtung, so dass höhere Antigen- oder Antikörperkonzentrationen aufgetragen werden können, wodurch die für Bindungsreaktionen erforderliche Zeit verkürzt wird.

Der fluoreszierende Enzymimmunoassay ist mit anderen EIAs identisch, mit der Ausnahme, dass fluoreszierende Substrate verwendet werden. Im fluoreszierenden EIA wird der Fluorophor durch eine Enzymreaktion erzeugt. Nach der Anregung des Fluorophors bei seiner optimalen Wellenlänge wird Licht mit einer charakteristischen Wellenlänge emittiert. Das emittierte Fluoreszenzlicht wird gemessen.

Zeitaufgelöster Fluoroimmunoassay:

Dieses Verfahren erfordert spezielle Instrumente und spezielle Fluoreszenzmarkierungen, um die Empfindlichkeit des Assays zu erhöhen. Die in diesem Assay verwendete Fluoreszenzmarkierung zeigt eine verzögerte Fluoreszenz mit einer Zeitspanne von 100 ns oder mehr zwischen Anregung und Emission. Die meisten Substanzen, die für die Hintergrundfluoreszenz verantwortlich sind, haben eine kurze Zerfallszeit. Daher wird die Messung des verzögerten Fluoreszenzsignals die Auswirkungen der Hintergrundfluoreszenz reduzieren.

Dieser Zweck wird durch die Verwendung eines speziellen zeitaufgelösten Fluorometers erreicht, das einen schnellen Lichtimpuls erzeugt, der den Fluorophor anregt. Die Fluoreszenz wird kurz nach der Anregung gemessen. Somit kann der Effekt eines nicht spezifischen Hintergrunds, der im Allgemeinen in weniger als 10 ns abfällt, eliminiert werden.

Die Fluorophore, die verzögerte Fluoreszenz zeigen, sind:

ich. Pyrenderivate mit einer Zerfallszeit von fast 100 ns.

ii. Seltenerdmetallchelat-Markierungen [wie Europium (Eu ³⁺ ), Samarium (Sm ³⁺ ) und Terbium (Tb ³⁺ )], die eine sehr lange Abklingzeit von etwa 50 bis 100 µs aufweisen.

Chemilumineszenz-Immunoassay:

Chemilumineszenz-Immunoassays (CL-EIAs) verwenden chemilumineszierende Substrate, die mit verschiedenen Enzymen reagieren. Die chemilumineszierende Substrat-Enzym-Reaktion erzeugt ähnlich der Biolumineszenz Licht. Die chemilumineszenten EIA-Systeme verbessern die Empfindlichkeit von RIAs hinsichtlich Empfindlichkeit, Zeiteffizienz und Einfachheit der Verfahren deutlich.

Chemilumineszenz-Immunoassays verwenden Chemilumineszenz-erzeugende Moleküle als Marker.

ich. Luminolderivate

ii. Acridiniumester

iii. Nitrophenyloxalatderivate

iv. Rutheniumtribipridyl mit Tripropylamin für die Elektrochemilumineszenz

v. Grundsätzlich unterscheiden sich die Assay-Methoden nicht von RIAs / FIAs.