Komplement-Assays von Antigenen und Antikörpern

Komplement-Assays von Antigenen und Antikörpern!

Es stehen Verfahren zur genauen Bestimmung jeder der Komplementkomponenten aller drei Komplementaktivierungswege und mehrerer Enzyme und Regulatoren des Komplementsystems zur Verfügung.

Viele der Assays sind jedoch nur in Forschungslabors verfügbar.

Es gibt zwei Arten von Komplement-Assays:

1. Assays, die Komplementproteine ​​als Antigene messen.

2. Assays, die die funktionelle Aktivität von Komplement messen.

Assays, die Komplementproteine ​​als Antigene messen, sind im Allgemeinen einfach durchzuführen, kostengünstig, weniger zeitaufwändig und können in vielen Labors durchgeführt werden. Diese antigenen Assays liefern jedoch keine Informationen über die funktionellen Fähigkeiten der Komplementkomponenten, da diese Komplementantigenassays sowohl funktional aktive Komplementkomponenten als auch Komplement-Abbauprodukte nachweisen.

ich. Antigenassays sind im Allgemeinen nicht so empfindlich wie funktionelle Assays.

ii. Antigenassays erkennen in bestimmten Körperflüssigkeiten nur geringe Mengen an Komplementkomponenten.

iii. ELISA-Assays stehen für die Messung von Spaltprodukten von Komplementkomponenten oder Komplexen zur Verfügung, die sich während der Komplementaktivierung bilden.

iv. Die Komplementaktivierung über den klassischen Weg kann gemessen werden, indem die Konzentrationen von C4d und C4 im Serum verfolgt werden.

v. Die ELISA-Messung von C1r-C1s-C1INH-Komplexen liefert ein Maß für die Komplementaktivierung über den klassischen Weg.

vi. Die Aktivierung des alternativen Wegs kann mit der ELISA-Methode gemessen werden, indem die Konzentrationen von Bb- oder C3bBbP-Komplexen im Kreislauf bewertet werden.

vii. Die Aktivierung eines klassischen oder alternativen Weges kann durch Messung der Konzentrationen von iC3b oder der löslichen Form des Membranangriffskomplexes sC5b6789 überwacht werden.

viii. ELISA-Kits zur Messung von Anaphylotaxin C3a und C5a im Serum oder Plasma sind erhältlich.

Probenhandhabung für Ergänzungsassays:

Die korrekte Handhabung von Proben ist für komplementäre Funktionstests von entscheidender Bedeutung. Einige der Komplementkomponenten sind sehr labil.

ich. Bei den meisten funktionellen Assays wird eher Serum als Plasma bevorzugt, da die zur Gewinnung von Plasma verwendeten Calcium-Chelatoren (wie EDTA, Heparin) antikomplementär sein können.

ii. Für funktionelle Assays sollte das Blut 30-60 Minuten bei Raumtemperatur und dann mindestens eine Stunde auf Eis gerinnen.

iii. Für Clq-Bindungsassays sollte das Blut 2 Stunden bei Raumtemperatur gerinnen. Das Gerinnsel wird eingefüllt und bei 0 ° C bis 4 ° C fünf Minuten lang zentrifugiert. Bei Verdacht auf kryopräzipitierende Antikörper sollten bei 37 ° C Blutgerinnselbildung und Zentrifugation des Blutes erfolgen, da bei gekühlter Probe die Komplementfixierung erfolgen kann.

iv. Serum- oder Plasmaproben sollten in mehreren kleinen Mengen aliquotiert und sofort bei 40 bis -80 ° C gelagert werden.

v. Wenn Seren transferiert werden, sollten sie gut verschlossen und in Behälter mit großen Mengen Trockeneis gestellt werden.

Funktionelle Assays ergänzen:

Die in komplementären funktionellen Assays verwendeten Puffer sind kritisch, da Änderungen der Molarität und Metallionenkonzentrationen die Komplementtiterwerte beeinflussen können. CH _50- Assay für klassischen Komplement-Pathway: Der einfachste funktionelle Assay des klassischen Pathways misst das gesamte hämolytische Komplement.

Das Fehlen einer der Komplementkomponenten führt zu einem gesamten hämolytischen Komplementtiter (CH ₅₀ ) von Null. Schaferythrozyten werden im Allgemeinen als Zielzellen verwendet, um die CH ₅₀ oder die funktionelle Aktivität der isolierten Komplementkomponenten zu messen. RBCs von Schafen sind empfindlicher gegenüber Antikörpern und komplementvermittelter Lyse als die RBCs anderer Spezies.

AH ₅₀ Assay für alternativen Komplementweg:

Kaninchen-Erythrozyten werden zur Messung von AH _{50 verwendet} . Kaninchen-Erythrozyten reagieren empfindlich auf antikörperunabhängige Lyse, die durch Humanserum vermittelt wird.

ich. CH _{50 -} und AH ₅₀ -Assays sind ausgezeichnete Screening-Assays, um einen genetischen Mangel an Komplementkomponenten auszuschließen.

ii. Normale CH ₅₀ -Aktivität mit reduzierten AH ₅₀ -Werten resultiert aus Defekten des alternativen Komplementweges.

iii. Unzulänglichkeiten in den Komponenten des Terminal-Komplements führen zum Verlust der Aktivitäten von CH ₅₀ und AH ₅₀ .

iv. Ein homozygoter Mangel einer Komplementkomponente hebt den hämolytischen Assay vollständig auf.

Das Ausmaß der Hämolyse wird durch viele Faktoren beeinflusst, wie z. B. die Erythrozytenkonzentration, die Fragilität (Alter) der Erythrozyten, die zur Sensibilisierung verwendete Antikörpermenge, die Art des Antikörpers (IgG oder IgM), die Ionenstärke des Puffersystems, P ^H Reaktionszeit, Temperatur und Calcium ^{2+ -} oder Magnesium ²⁺ -Konzentrationen. Der Wert für CH50-Einheiten im Humanserum wird auf verschiedene Weise berechnet, beispielsweise durch die Von-Krough-Gleichung.

Messung des Funktionsmangels einzelner Ergänzungskomponenten:

Wenn die Anamnese und die Symptome eines Patienten auf einen möglichen Mangel an Komplementkomponenten hindeuten, können hämolytische Titrationen der einzelnen Komponenten erforderlich sein. Um Lyses von Erythrozyten zu erzeugen, sind Anwesenheit und Aktivierung der gesamten Komplementkomponenten (C1 - C9) erforderlich. Wenn eine Komponente fehlt, tritt keine Hämolyse auf. Reine Präparationen von jeder der einzelnen Komplementkomponenten werden benötigt, um die Abwesenheit einer bestimmten Komplementkomponente im Serum oder Plasma eines Patienten festzustellen.

Zur Messung einzelner Komplementkomponenten sind teilweise gereinigte Komponenten erforderlich. Die Messung von C4 ist jedoch eine Ausnahme, da C4-defizientes (C4D) Meerschweinchenserum zur Verfügung steht. Seren von Menschen mit C2-Mangel und Meerschweinchen und Kaninchen mit C6-Mangel sind in wenigen Laboratorien erhältlich.

Funktionale Komplement-Assays der einzelnen Komponenten sind empfindlich und liefern genaue Informationen über die Aktivität einer Komplementkomponente. Die meisten dieser Tests sind jedoch auf Forschungslabors beschränkt.

Messung der individuellen Komplementkomponente durch Antigenanalyse:

Die einfache radiale Immundiffusion ist die am häufigsten angewendete Methode zur Quantifizierung von Komplementkomponenten wie C3, C4 und Faktor B. Es sollte daran erinnert werden, dass alle funktionellen Komplement-Assays durch eine anti-komplementäre Wirkung des Serums inhibiert werden können (die von Antigen- Antikörperkomplexe, Heparin, Chelatbildner und aggregiertes Immunglobulin).

Ergänzungsfixierungstest:

Bei einer Antigen-Antikörper-Interaktion werden die Komplementkomponenten aktiviert und verbraucht. In-vitro-Testkonsum von Komplement zeigt somit das Vorhandensein einer Antigen-Antikörper-Wechselwirkung an. Dieses Prinzip dient zum Nachweis und zur Messung von Antigen oder Antikörpern im Komplementbindungstest.

Der Test wird in zwei Schritten durchgeführt. In der ersten Stufe findet eine Antigen-Antikörper-Wechselwirkung statt und das Komplement wird verbraucht. In der zweiten Stufe wird ein Indikatorsystem verwendet, um festzustellen, ob das Komplement in der Reaktion der ersten Stufe verbraucht wird oder nicht.

ich. Wenn das Komplement in der ersten Stufe verbraucht wird, bedeutet dies, dass in der ersten Stufe eine Antigen-Antikörper-Reaktion stattgefunden hat.

ii. Wenn Komplement nicht verbraucht wird, bedeutet dies, dass in der ersten Stufe keine Antigen-Antikörper-Wechselwirkung stattgefunden hat.

Nachweis des Antikörpers durch komplementären Fixierungstest:

Erste Stufe:

Feste Konzentrationen an bekanntem Antigen und Komplement (üblicherweise wird frisches Meerschweinchenserum als Komplementquelle verwendet) werden genommen. Das Serum (unbekannte Antikörper) wird zugegeben und inkubiert.

A. Bekanntes Antigen + Komplement + Serum (entsprechende Antikörper vorhanden). Das Komplement wird während der Inkubation verbraucht.

B. Bekanntes Antigen + Komplement-1-Serum (entsprechende Antikörper fehlen). Das Komplement wird nicht verbraucht, da das Serum keine Antikörper enthält, die für das bekannte Antigen spezifisch sind.

Zweite Etage:

Die mit Kaninchen-Anti-Schaf-Erythrozyten-Antikörpern beschichteten Schaf-Erythrozyten werden zu den Röhrchen gegeben. In Gegenwart von Komplement werden die Erythrozyten der Schafe lysiert (Hämolyse). Ohne Komplement lysieren die Erythrozyten nicht (keine Hämolyse).

Antwort: Da das Komplement während der Reaktion der ersten Stufe verwendet wird, werden die mit Antikörper beschichteten Schaf-Erythrozyten nicht lysiert. Das Fehlen einer Hämolyse legt daher nahe, dass das Serum spezifische Antikörper gegen das im Test verwendete Antigen enthält.

B. Da das Komplement in der ersten Stufe nicht verwendet wird, werden die mit Antikörper beschichteten Schafserythrozyten durch das Komplement in der zweiten Stufe hämolysiert. Das Vorliegen einer Hämolyse legt daher nahe, dass das Serum keine spezifischen Antikörper gegen das verwendete Antigen enthält.

Komplement-Fixationstests werden in klinischen Labors und in der Forschung häufig eingesetzt. Viren, Serumantikörper gegen Virusinfektionen, Antikörper gegen Treponema pallidum, die Syphilis verursachen, Anti-Pilz-Antikörper (Coccidioidomycosis immitis, Histoplasma capsulatum), Anti-Mycoplasma pneumoniae-Antikörper und Anti-Riketsia-Antikörper werden durch Komplementfixierungstest nachgewiesen.