3 Klassifikationen der Agglutinationstechniken
Drei Typen, in die die Agglutinationstechniken von Zellen eingeteilt werden, sind: 1. direkte Agglutination, 2. indirekte (passive) Agglutination und 3. reverse (passive) Agglutination.
1. Direkter Agglutinationstest:
Zellen (wie Bakterien, Pilze und Erythrozyten) und unlösliche partikuläre Antigene können durch ihre spezifischen Antikörper direkt agglutiniert werden. Der Antikörper verfügt über zwei Fab-Arme, mit denen er an zwei Zellen an Antigene binden kann. Ebenso binden viele Antikörpermoleküle an eine Anzahl von Zellen, um ein Gitter zu bilden.
Diese Gitterbildung wird visuell als Klumpen gesehen. Daher zeigt die Bildung von Klumpen das Vorhandensein einer Antigen-Antikörper-Bindung. Mangelnde Agglutination weist auf das Fehlen einer Antigen-Antikörper-Reaktion hin.
Verwendung des direkten Agglutinationstests:
ein. Identifizierung von Mikroben:
Die in Kulturmedien gezüchteten Bakterienkolonien werden unter Verwendung bekannter Antiseren gegen Mikroben identifiziert. Das antimikrobielle Antiserum, das eine sichtbare Agglutination erzeugt, identifiziert die Bakterien.
b. Diagnose mikrobieller Infektionen durch Nachweis der Anwesenheit von Antikörpern gegen Mikroben im Serum. Bekannte mikrobielle Antigene werden mit dem Patientenserum gemischt und das Auftreten einer Agglutination zeigt das Vorhandensein von Serumantikörpern gegen die Mikrobe an.
c. ABO-Blutgruppen menschlicher Erythrozyten (unter Verwendung von Antiseren).
Die Agglutinationstests werden entweder auf dem Objektträger (Objektträgeragglutinationstest) oder in Röhrchen (Rohragglutinationstest) durchgeführt.
ich. Der Agglutinationstest der Objektträger ist einfach und leicht durchzuführen und dauert nur wenige Minuten, um den Test durchzuführen.
ii. Der Röhrchenagglutinationstest wird verwendet, um die Menge an Serumantikörpern gegen eine Mikrobe zu quantifizieren, indem das Serum seriell verdünnt wird und die verdünnten Seren dann mit einer konstanten Menge mikrobieller Antigene gemischt werden. Nach entsprechender Inkubation wird die höchste Verdünnung des Serums mit sichtbarer Agglutination als Titer des Serums genommen (z. B. Widal-Röhrchen-Test, Brucella-Röhrchen-Test). Der Titer gibt die Konzentration der Antikörper im Serum wieder. Je höher der Titer, desto höher ist die Konzentration der Antikörper.
Die Objektträger-Tests zum Nachweis von Serumantikörpern gegen Infektionserreger werden als erste Screening-Tests verwendet. Die Seren der positiven Objektträger-Tests sollten durch Röhrchen-Tests erneut getestet werden, um die Ergebnisse der Objektträger-Tests zu bestätigen. Der Dia-Test kann zu irreführenden Ergebnissen führen, insbesondere bei sehr hohen Antikörpern im Serum (z. B. Prozone-Phänomen mit Brucella-Antikörpern).
In den Agglutinationstestsystemen gibt es große Schwankungen. Wenn also die Serumtiterwerte eines Patienten zweimal geprüft werden, ist die Differenz zwischen den Titerwerten nur dann signifikant, wenn sich die Titerwerte um mindestens zwei Doppelverdünnungen [oder die Differenz um zwei Röhrchen (vierfacher erster Wert) unterscheiden. ] (z. B. im Widal-Röhrchentest wird das Serum in zwei Falten verdünnt: 1 zu 20, 1 zu 40, 1 zu 80, 1 zu 160, 1 zu 320 und 1 zu 640. Wenn ein Patient einen ersten Widal-Test hat Titer von 1 in 160 ist der zweite Widal-Testtiter signifikant, wenn er 1 zu 640 oder mehr als 1 zu 640 beträgt.)
Heterophiler Antikörpertest:
Heterophiler Antikörpertest ist ein Hämagglutinationstest zum Nachweis von Antikörpern gegen das Epstein Barr (EB) -Virus, die eine infektiöse Mononukleose verursachen. Die während der infektiösen Mononukleose gebildeten IgM-Antikörper reagieren kreuzreagiert mit equinen RBC-Oberflächenantigenen (wahrscheinlich aufgrund der antigenen Ähnlichkeit zwischen EB-Virus und equinen RBC-Oberflächenproteinen) und verursachen eine Hämaglutination.
Indirekter (passiver) Agglutinationstest:
Beim indirekten Agglutinationstest werden bekannte lösliche Antigene auf andere Zellen (z. B. Erythrozyten von Schafen oder Puten) oder inerte Partikel (z. B. Latex, Bentonit, Kohle, Polystyrol) aufgetragen, die als passive Träger von Antigenen wirken.
Viele Antigene können direkt oder nach Behandlung der Erythrozyten mit Formalin, Gerbsäure oder Glutaraldehyd auf Erythrozyten aufgebracht werden. Die Vorteile der Verwendung von Erythrozyten zum Beschichten sind ihre leichte Verfügbarkeit und Lagerfähigkeit. Darüber hinaus sind diese Tests sehr empfindlich.
Das Testserum wird mit bekannten Antigen-beschichteten Erythrozyten oder Latex gemischt.
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Wenn das Testserum Antikörper aufweist, agglutinieren die Erythrozyten oder Latexpartikel und bilden sichtbare Klumpen.
Hämagglutinationsassay:
Hämagglutinationstests sind einfach und leicht durchzuführen. Sowohl qualitative als auch quantitative Tests können mit der Hämagglutinationstechnik durchgeführt werden.
Das Testserum wird in einer Verdünnungslösung in Mikrotiterplattenvertiefungen seriell verdünnt.
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Mit einem bekannten Antigen beschichtete Erythrozyten werden zu allen Vertiefungen in gleichen Mengen zugegeben. Es werden geeignete Positivkontrollen, Negativkontrollen und Reagenzkontrollen verwendet. Die Platte wird gut geschüttelt und an einem vibrationsfreien Ort inkubiert.
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Nach der Inkubation wird die Platte mit dem bloßen Auge zur Agglutination gelesen.
Positive Reaktion:
Wells mit Agglutination weisen auf die Bindung von Antigen-beschichteten RBCs mit entsprechenden Antikörpern im Testserum hin. Der Boden der agglutinierten Vertiefung wird so beschrieben, dass sie ein Teppichaussehen hat.
Negative Reaktion:
In Wells, in denen keine Antigen-Antikörper-Bindung vorliegt, tritt keine Agglutination von Erythrozyten auf. Aufgrund der Schwerkraft setzen sich die Erythrozyten an der Unterseite der Vertiefungen ab und geben ein "knopfähnliches" Aussehen, wobei der Rand des "Knopfes" scharf und regelmäßig ist.
Antikörpertiter des Testserums:
Die Serumverdünnung, die eine 50% ige Agglutination ergibt, verglichen mit der Vertiefung, die eine vollständige Agglutination (100%) zeigt, ist der Antikörpertiter des Testserums. Hämagglutinations-Kits sind für den Antikörpernachweis gegen Hepatitis B-Virus, HIV, Thyreoglobulin usw. erhältlich.
Gelatineteilchen-Agglutination:
Gelatinepartikel sind eine Alternative zu Erythrozyten für die Partikelagglutinationstests. Spezielle Gelatineteilchen (Durchmesser etwa 3 um) haben eine stark hydrophile Oberfläche und daher gibt es keine unspezifische Bindung von Materialien in der Probe. Gelatineteilchen werden durch Phasentrennung und dreidimensionale Vernetzung bei 40 ° C hergestellt. Die entstehenden Partikel werden mit Formaldehyd oder Gluteraldehyd fixiert.
Gelatineteilchen weisen keine Antigenität auf und sind daher frei von Problemen, die mit Hämaglutinationsassays verbunden sind (wie etwa die heterophilen Antikörper, die mit RBCs unspezifisch reagieren können und in Hämagglutinationsassays falsch positive Agglutinationen ergeben).
Latex-Agglutinationstest:
Abgesehen von Erythrozyten und Gelatine können auch wenige andere Partikel verwendet werden, um Antigene auf ihrer Oberfläche zu tragen. Solche mit Antigen beschichteten Teilchen agglutinieren, wenn sie mit spezifischen Antikörpern gemischt werden. Latexpartikel können mit Protein- und Polysaccharidantigenen beschichtet werden. Diese mit Antigen beschichteten Partikel agglutinieren in Gegenwart von Antikörpern.
Umgekehrter passiver Hämagglutinationsassay:
Bei reversen passiven Hämagglutinationsassays werden die Erythrozyten mit bekannten Antikörpern beschichtet. Diese Kits dienen zum Nachweis der Antigene in den Testproben, wie z. B. HB s Ag im Serum.
Rose-Waaller-Test:
Dies ist ein passiver Hämagglutinationstest zum Nachweis von Rheumafaktor. Eines der Merkmale des menschlichen Rheumafaktors ist, dass er sowohl mit menschlichem IgG als auch mit Kaninchen-IgG binden kann. Schaf-Erythrozyten sind mit subagglutinierenden Mengen von Anti-Schaf-IgG-Antikörpern (in Kaninchen gezüchtet) beschichtet. Die Rheumafaktoren agglutinieren Schaf-Erythrozyten, die mit Kaninchen-Anti-Schaf-IgG beschichtet sind.
Flockungstest:
Die Flockung ist ein anderer Typ eines Antigen-Antikörper-Komplexbildungsassays, der zum Nachweis und zur Quantifizierung der Antikörper verwendet wird. Im Gegensatz zu Agglutination und Präzipitation (wobei sich die Antigen-Antikörper-Komplexe bis zum Boden des Röhrchens absetzen), aggregieren die Antigen-Antikörper-Komplexe im Flockungstest und bleiben als Flocken in Suspension, und die Ergebnisse werden unter einem Mikroskop abgelesen. Diese Technik wird im VDRL-Test (Forschertest für Geschlechtskrankheiten) zum Nachweis von Antikörpern gegen Treponema pallidum, den Bakterien, die Syphilis verursachen, eingesetzt.
Virale Hämagglutination:
Die virale Hämagglutination ist eine spezielle Kategorie der Erythrozytenagglutination, bei der keine Antigen-Antikörper-Reaktion stattfindet. Bestimmte Viren binden an die Oberflächenproteine von Erythrozyten, und diese Bindung führt zu einer spontanen Agglutination von Erythrozyten.
Die spontane Agglutination von Erythrozyten durch ein Virus kann durch spezifische antivirale Antikörper verhindert werden. Die Antikörper gegen das Virus binden an die viralen Oberflächenantigene und verhindern die Interaktion von Virus und Erythrozyten, und folglich sind die Erythrozyten nicht agglutiniert. Es wird als viraler Hämagglutinations-Inhibierungsassay bezeichnet und wird zur Quantifizierung von viralen Antikörpern im Serum von Patienten verwendet.
Test auf Kaltagglutinine:
Antikörper, die während bestimmter Infektionen (insbesondere Mycoplasma pneumoniae) und Autoimmunerkrankungen gebildet werden, haben eine besondere Fähigkeit, Erythrozytenagglutin bei 4 ° C zu agglutinieren. Diese Antikörper werden kalte Agglutinine genannt.
Reihenverdünnungen des Patientenserums werden mit 1% Erythrozyten bei 4 ° C über Nacht inkubiert.
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Die Röhrchen werden auf Agglutination untersucht. Wenn eine Agglutination vorliegt, werden die Röhrchen bei 37 ° C reinkubiert.
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Die Deagglutination von Erythrozyten bei 37 ° C zeigt an, dass das Serum kalte Agglutinine enthält. Der Kaltagglutinin-Test wird zur Diagnose einer Mycoplasma pneumoniae-Infektion verwendet. 50 bis 80 Prozent der Patienten, die mit Mycoplasma pneumoniae infiziert sind, haben kaltes Agglutinin, das zum IgM-Typ gehört.
