Immunfluoreszenz zum Nachweis von Antigenen in Zellen
Immunfluoreszenz zum Nachweis von Antigenen in Zellen!
Coins (1941) führte fluoreszierende Verbindungen als immunochemische Mittel zum Nachweis von Antigenen in Geweben ein.
Immunfluoreszenz wird zum Nachweis von Antigenen in Zellen oder Geweben (unter Verwendung bekannter Antikörper) sowie zum Nachweis von Antikörpern im Serum (unter Verwendung bekannter Antigene) verwendet. Fluoreszenz ist die Emission von Licht einer Farbe, wenn die Substanz einem Licht einer anderen Farbe ausgesetzt wird. Wenn eine fluoreszierende Substanz mit einem Licht einer bestimmten Wellenlänge angeregt wird, absorbiert sie das Licht und emittiert ein Licht einer anderen Wellenlänge.
ich. Fluoresceinisothiocyanat (FITC) hat ein Absorptionsmaximum von Licht bei 490–495 nm und emittiert das Licht bei 530 nm (grüne Farbe).
ii. Tetramethylrhodaminisothiocyanat hat ein Absorptionsmaximum von Licht bei 550 nm und emittiert rotes Farblicht (580 nm).
ein. Direkte Immunfluoreszenz:
Diese Technik wird verwendet, um Antigene in Zellen oder Geweben nachzuweisen.
Das Gewebe, das ein unbekanntes Antigen aufweist, wird an einem Objektträger fixiert.
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Ein bekanntes Antiserum (spezifisch für das Antigen von Interesse), das mit FIT (bekannt als Konjugat) konjugiert ist, wird auf das Gewebe geschichtet und inkubiert.
ich. Wenn sich das Antigen von Interesse in den Geweben befindet, bindet das Konjugat an das Antigen.
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Dann wird der Objektträger gewaschen, um das ungebundene Konjugat zu entfernen.
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Der Objektträger wird dann unter dem Fluoreszenzmikroskop betrachtet.
ich. Wenn sich im Gewebe Antigen befindet, wird eine hellgrüne Farbe sichtbar.
ii. Wenn sich kein Antigen im Gewebe befindet, wäre das gesamte Konjugat während des Waschschritts gewaschen worden und folglich gibt es keine grüne Farbe.
Diese Technik wird auch verwendet, um das Vorhandensein bakterieller oder viraler Antigene in infizierten Geweben nachzuweisen.
b. Indirekte Immunfluoreszenz:
Diese Technik dient zum Nachweis von Antikörpern im Serum.
Zellen, die bekannte Antigene enthalten, werden an Glasobjektträger fixiert.
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Das Testserum wird über den Objektträger gegeben und inkubiert.
ich. Wenn sich Antikörper (gegen die Antigene in Zellen) im Serum befinden, binden die Antikörper an die Antigene in den Zellen.
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Dann wird der Objektträger gewaschen, um die ungebundenen Serumkomponenten zu entfernen.
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An FITC konjugiertes Anti-Human-Immunglobulin wird zugegeben und inkubiert.
ich. Das FITC-konjugierte Anti-Human-Immunglobulin bindet an die an die Zellantigene gebundenen Serumantikörper.
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Nach dem Waschen wird der Objektträger unter einem Fluoreszenzmikroskop betrachtet.
ich. Das Vorhandensein einer hellgrünen Farbe zeigt an, dass das Serum Antikörper gegen die Antigene in den Zellen aufweist.
ii. Das Fehlen einer grünen Farbe zeigt das Fehlen von Serumantikörpern gegen die Antigene in den verwendeten Zellen an.
