HLA: Histokompatibilitäts-Testverfahren

Histokompatibilitäts-Testmethoden!

Das HLA-System ist weitgehend polymorph. Die polymorphe Natur von HLA-Allelen wurde zunächst durch serologische Methoden gefunden und definiert, und die HLA-Antigene erhielten Zahlen. Später wurde festgestellt, dass Antigene mit der gleichen serologischen Spezifität unterschiedliche Aminosäuresequenzen aufweisen können. Bis 1999 überstieg die Anzahl der bekannten HLA-Allele 1000 und die Zahl steigt weiter. Aufgrund des umfangreichen Polymorphismus ist die Nomenklatur der HLA-Allele komplex und es ist auch schwierig, die Nomenklatur zu verstehen, es sei denn, die Person befindet sich im Bereich der Histokompatibilität.

Den ersten sequenzierten Allelen wurden Namen mit zwei Ziffern zugewiesen, die ihrer serologischen Spezifität entsprachen. Auf die ersten beiden Ziffern folgen zwei weitere Ziffern, die die chronologische Reihenfolge der Benennung durch das WHO-Nomenklaturkomitee für Faktoren des HLA-Systems angeben. (Zum Beispiel: Das erste Allel, das aus einem HLA-A2-Gen sequenziert wurde, wurde als HLA-A 0201 bezeichnet, und das zweite Allel wurde als HLA-A 0202 bezeichnet.)

Die HLA-Typisierung erfolgt durch serologische Typisierungsmethoden oder molekulare Typisierungsmethoden. Die serologischen HLA-Typisierungsmethoden erfassen die Epitope der HLA-Moleküle, während die molekularen Methoden die Nukleotidsequenzen nachweisen.

ich. Die HLA-Typisierung, die Gruppen von Allelen definiert (normalerweise angenäherte serologische Spezifitäten), wird als niedrigauflösende oder generische Typisierung bezeichnet (z. B. HLA-DRB1-04).

ii. Typisierung, bei der alle bekannten Allele aufgelöst werden, wird als hochauflösende HLA-Typisierung bezeichnet (z. B. HLA-DR BI x401).

iii. Eine Typisierung, die über serologische Spezifitäten hinausgeht, jedoch kein Allel-Niveau erreicht, wird als Typisierung der mittleren Auflösung bezeichnet (z. B. HLA-DRB1-0401/09/13/16/21/26/33).

Das Nationale Markenspenderprogramm hat Code erstellt, um die Verwaltung dieser komplexen Daten mit mittlerer Auflösung zu erleichtern. In diesem System lautet der Name für HLA-BRBl-0401/09/13/16/21/26/23 / DRBl-04EJV.

Histokompatibilitätsprüfung durch serologische Methoden:

Lymphozyten werden zur serologischen HLA-Typisierung, zum Antikörperscreening und zum Cross-Matching verwendet.

Isolierung von Lymphozyten zur HLA-Typisierung:

ich. Periphere Venenblut wird mit Ficoll-Hypaque gemischt und zentrifugiert. Die Schicht, die periphere mononukleäre Blutzellen enthält, wird abgesaugt, gewaschen und verwendet.

ii. Verwendet werden Lymphozyten, die aus den Lymphknoten und der Milz von Kadavern isoliert werden.

iii. Die HLA-Typisierung für Klasse-II-Antigene erfolgt mit angereicherten B-Zellpopulationen (etwa 80 Prozent der normalen T-Zellen aus peripherem Blut sind T-Zellen, denen auf ihrer Oberfläche keine Klasse-II-Antigene fehlen).

iv. Mit Anti-CD2 oder Anti-CD3-mAbs beschichtete Magnetkügelchen werden zur Isolierung von T-Zellen verwendet. und mit Anti-CD19-mAbs beschichtete Magnetkügelchen werden zur Isolierung von B-Zellen verwendet.

Nachweis von HLA-Antigenen von Lymphozyten:

Mikrozytotoxizitätsassay ist ein Komplement-abhängiger Lymphcytotoxizitätsassay. Gefrorene Schreibfächer mit Wells, die mit verschiedenen Antikörpern gegen HLA-Antigene beschichtet sind, sind im Handel erhältlich.

Etwa 2000 Lymphozyten werden in jede Vertiefung der Schale gegeben und 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. (Antikörper in jeder Vertiefung binden an spezifische HLA-Antigene auf der Oberfläche von Lymphozyten, falls vorhanden.)

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Fünf ul Komplement (normalerweise Kaninchenserum) werden zu jeder Vertiefung gegeben und für 60 Minuten inkubiert (Komplementproteine ​​verursachen den Tod von mit mAbs beschichteten Lymphozyten. In Abwesenheit von mAb-Bindung mit Lymphozyten wird das Komplement nicht aktiviert und die Lymphozyten werden nicht aktiviert.) werden nicht getötet).

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Der Farbstoff Eosin Y, gefolgt von Formaldehyd (Formaldehyd fixiert die Reaktion) wird zugegeben.

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Dann werden die toten Zellen und lebenden Zellen in jeder Vertiefung unter einem Phasenkontrastmikroskop gezählt.

ich. Geschwollene und dunkle Zellen sind tote Zellen (Der Farbstoff Eosin Y dringt in tote Zellen ein).

ii. Helle und refraktile Zellen sind lebende Zellen (Der Farbstoff Eosin Y dringt nicht in lebende Zellen ein).

Jede Vertiefung in der Ablage wird einzeln nach toten Zellen und lebenden Zellen betrachtet. Der Prozentsatz der toten Zellen in jeder Vertiefung wird berechnet und die Bewertung erfolgt gemäß Tabelle 27.5.

Tabelle 27.5: Bewertung des Lymphcytotoxizitätstests für HLA:

Der HLA-Typ eines Individuums wird durch Interpretation der Reaktion der Lymphozyten des Individuums mit verschiedenen Antiseren bestimmt, die im komplementabhängigen Lymphcytotoxizitätstest verwendet werden.

ich. Es wird erwartet, dass jedes Individuum zwei HLA-A-, zwei HLA-B- und zwei HLA-C-Antigene auf der Oberfläche von Lymphozyten hat.

ii. Wenn ein Individuum im Test nur ein HLA-A- oder HLA-B- oder HLA-C-Antigen aufweist, ist das Individuum wahrscheinlich für dieses bestimmte Antigen homozygot, oder das im Test verwendete Antisera-Panel hat keinen spezifischen Antikörper gegen das zweite Antigen Antigen oder es gibt eine geringe Expression von HLA-Molekülen auf der Lymphozytenoberfläche.

Der komplementabhängige Lymphcytotoxizitätsassay für HLA-DR- und HLA-DQ-Antigene wird unter Verwendung von B-Zellen durchgeführt, die durch mit mABs beschichtete Magnetkügelchen oder B-Zellen, die über Nylonwolle isoliert wurden, isoliert wurden.

Die meisten HLA-Typisierungsseren werden von Frauen mit mehreren Patienten erhalten. Da die mutioparen Frauen wiederholt den HLA-Antigenen der Feten ausgesetzt sind, haben die Seren der multiparen Frauen Antikörper gegen HLA-Antigene. Fast 200 verschiedene Antiseren werden verwendet, um die HLA-Antigene eines Individuums zu typisieren.

Anfangs wurde angenommen, dass mAbs für jedes der HLA-Antigene entwickelt werden könnten und die HLA-Typisierung einfach wäre. Viele mAbs binden jedoch an die üblichen Epitope und nicht an die privaten Epitope der HLA-Antigene. Darüber hinaus fixieren viele murine mAbs kein Komplement (und daher ist ihre Verwendung in komplementabhängigen Lymphcytotoxizitätsassays begrenzt).

Maus-mAbs können jedoch in ELISA-Verfahren und Durchflusszytometriemethoden verwendet werden, die kein Komplement erfordern. In letzter Zeit bevorzugen viele Laboratorien die molekulare HLA-Typisierung anstelle der serologischen HLA-Typisierung.

Screening des Serums des Transplantatempfängers auf Antikörper gegen l-ILA-Antigene (Antikörperscreening):

Das Vorhandensein von Antikörpern gegen HLA-Antigene im Serum eines wartenden Organtransplantationsempfängers wird normalerweise durch Komplement-abhängige Lymphcytotoxizität erreicht. Lymphozyten mit bekannten HLA-Antigenen und Komplement werden mit dem Serum des Empfängers gemischt. Nach entsprechender Inkubation werden die toten Lymphozyten und lebenden Lymphozyten gezählt. Der prozentuale Panelreaktive Antikörper (PRA) wird dann berechnet.

PRA = Anzahl der positiven Zellen / Anzahl der gesamten Feldzellen x 100

PRA gibt das Ausmaß der Sensibilisierung des wartenden Empfängers gegen HLA-Antigene an.

ELISA-Methode zum Screening von Serum-HLA-Antikörpern:

Die ELISA-Methode ist einfach, schnell und erfordert keine lebenden Lymphozyten sowie Komplement. Affinitätsgereinigte HLA-Antigene werden an den Wänden der Mikrotiterplatte aufgetragen

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Empfänger-Serum wird zugegeben und inkubiert

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Nach dem Waschen wird enzymkonjugiertes Anti-Human-IgG zugegeben und inkubiert.

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Nach dem Waschen wird Substrat zugegeben und inkubiert.

ich. Die Entwicklung der Farbe in einer bestimmten Vertiefung zeigt das Vorhandensein von IgG-Antikörpern gegen das HLA-Antigen an, das mit dieser bestimmten Vertiefung beschichtet ist.

ii. Die Nichtentwicklung von Farbe in einer bestimmten Vertiefung zeigt das Fehlen von Antikörpern gegen das bestimmte HLA-Antigen an, das mit dieser Vertiefung beschichtet ist.

Durchflusszytometer zum Nachweis von Serum-HLA-Antikörpern:

Mit HLA-Antigenen beschichtete Mikrokügelchen werden mit dem Patientenserum und dann mit fluoreszenzmarkierten Anti-Human-IgG-Antikörpern inkubiert. Der Prozentsatz der Perlen, der sich über dem Hintergrund verfärbt, liefert das Maß für die prozentualen Panel-Reaktiven Antikörper (PRA) des Patienten.

Queranpassung:

Wenn das Blut eines wartenden Empfängers Antikörper gegen die Spender-HLA-Antigene enthält, werden die HLA-Antigene auf den Spenderzellen bei der Transplantation von den Antikörpern des Empfängers angegriffen. Daher ist es vor der Transplantation wichtig zu wissen, ob der Empfänger Antikörper gegen die Spender-HLA-Antigene hat.

Wenn im Spender des Empfängers Spender-HLA-Antigen-spezifische Antikörper vorhanden sind, wird das Transplantat abgelehnt. Ein Kreuzabgleich wird durchgeführt, um das Vorhandensein von Serumantikörpern des wartenden Empfängers gegen die vorgeschlagenen Spender-HLA-Antigene nachzuweisen.

Lymphzytotoxizität Cross Matching mit peripheren Blutlymphozyten:

Periphere Blutlymphozyten des vorgeschlagenen Spenders (der ungefähr 80 Prozent T-Zellen (die MHC-Klasse I-Antigene tragen) und 20 Prozent B-Zellen und Monozyten (die MHC-Klasse I- und Klasse II-Antigene tragen) werden mit dem Serum des wartenden Empfängers gemischt und inkubiert .

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Komplement wird hinzugefügt und inkubiert.

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Der Farbstoff Eosin Y wird zugegeben und inkubiert.

ich. Die Anzahl toter und lebensfähiger Zellen wird gezählt und der Prozentsatz toter Zellen wird berechnet. 50 Prozent oder mehr Zelltod deuten auf einen starken positiven Kreuzvergleich hin (dh das Serum des Empfängers weist Antikörper auf, die mit Spender-HLA-Antigenen reagieren können). Eine starke positive Kreuzung zwischen einem Empfänger und einem vorgeschlagenen Spender ist eine Kontraindikation für eine Organtransplantation vom Spender zum Empfänger.

Um herauszufinden, ob die Antikörper des Empfängers gegen die Klasse-I- oder Klasse-II-Antigene gerichtet sind, werden T-Zell-Lymph-Cytotoxizität (unter Verwendung angereicherter T-Zellen) bzw. B-Zell-Lymph-Cytotoxizität (unter Verwendung angereicherter B-Zellen) durchgeführt.

Das Cross-Cytometer des Durchflusszytometers ist 30-250 Mal empfindlicher als die visuellen serologischen Methoden zum Nachweis von IgG-Antikörpern gegen HLA-Antigene auf der Oberfläche von Lymphozyten.

Periphere Blutlymphozyten des vorgeschlagenen Spenders werden mit markierten (beispielsweise grünem Licht emittierenden Fluoreszenzfarbstoff) anti-CD3-mAbs inkubiert, die an T-Zellen binden.

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Die markierten ani-CD3-gebundenen T-Zellen werden im Durchflusszytometer von B-Zellen getrennt.

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Die getrennten, gefärbten T-Zellen werden nun mit dem Serum des wartenden Empfängers inkubiert.

ich. Die Serumantikörper des Empfängers gegen die Spender-T-Zell-HLA-Antigene binden sich, falls vorhanden, an die T-Zellen.

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Nach dem Waschen wird ein mit Flurochrom (das eine andere Farbe als Grün, beispielsweise rote Farbe emittiert) markiertes Anti-Human-IgG hinzugefügt und inkubiert.

ii. Das mit Florochrom markierte Anti-Human-IgG bindet an die HLA-Antikörper des Empfängers, die an die Spender-T-Zellen gebunden sind.

Das Durchflusszytometer zählt die Anzahl der T-Zellen (rote und grüne Farbe) und T-Zellen (grüne Farbe) und erstellt ein Histogramm.

Cross Matching für Autoantikörper gegen Lymphozyten:

Während eines Kreuzvergleichs können sich Autoantikörper gegen Lymphozyten im Serum des Empfängers unspezifisch an die Spenderlymphozyten binden und zu einem falsch positiven Kreuzvergleich führen. und folglich wird der Spender irrtümlicherweise vom Organspender an den jeweiligen Empfänger ausgeschlossen. Autoantikörper können auch das Vorhandensein spezifischer Anti-Donor-Antikörper maskieren.

Das Vorhandensein von Autoantikörpern gegen Lymphozyten wird durch den Auto-Cross-Match nachgewiesen, bei dem die eigenen Lymphozyten des Empfängers und das Serum in einem Standard-Zytotoxizitätstest kombiniert werden. Autoantikörper-Kreuzvergleiche werden routinemäßig in Verbindung mit allen lebenden Spenderkreuzübereinstimmungen für jedes getestete Serum durchgeführt.

Molekularbiologische Methoden zur HLA-Typisierung:

Die meisten der molekularen Typisierungsmethoden verwenden die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) -Technik, um die zur Typisierung erforderlichen HLA-Gensegmente selektiv zu amplifizieren.

Sequenzspezifisches Priming (SSP) Typisierung:

DNA des Individuums wird aus Zellen oder Geweben extrahiert

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Röhrchen mit unterschiedlichen Primer-Sets für verschiedene HLA-Gene werden mit DNA versetzt. Ein zusätzlicher Primer-Satz ist als positive Kontrolle der Amplifikation in allen Röhrchen enthalten.

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Die anderen Komponenten der PCR-Reaktion (wie DNA-Nukleotide, DNA-Polymerase, Puffer) werden zugegeben und der thermische Zyklus durchgeführt.

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Die amplifizierten Produkte werden mit Ethidiumbromid in einem Gel elektrophoretisiert und unter UV-Licht fotografiert.

ich. Das Vorhandensein einer Bande zeigt an, dass die DNA-Probe die Sequenz aufweist, die dem bestimmten HLA-Typ entspricht.

ii. Das Fehlen einer Bande zeigt an, dass die DNA-Probe nicht die bestimmte Sequenz des HLA-Typs enthält.

iii. Das interne Verstärkungskontrollband sollte für die Interpretation vorhanden sein.

Primer für die HLA-Typisierung sind im Handel erhältlich.

ich. Für HLA-A, B und C sind ca. 100-200 Reaktionen erforderlich.

ii. Für die HLA-DRB-Typisierung sind etwa 20-30 Reaktionen erforderlich.

Sequenzspezifische Oligonukleotidsonden-Hybridisierung (SSOP):

Das SSOP-Verfahren umfasst die selektive Amplifikation des HLA-Targets, gefolgt von der Hybridisierung an ein Panel von Oligonukleotidsonden. Es gibt zwei SSOP-Formate.

ich. Punkt oder Slot Blot:

Die amplifizierte DNA ist an den festen Träger gebunden (wie z. B. eine Nylonmembran) und die Hybridisierungssonde befindet sich in Lösung.

ii. Umgekehrter Punkt oder Slot-Blot:

Die Sonde wird an den festen Träger gebunden und in Lösung mit der amplifizierten DNA hybridisiert.