Biologische Methoden der Arzneimittelbewertung

Wenn physikalische oder chemische Bewertungsmethoden oder Probenmengen sehr wenig geeignet sind, um ein zufriedenstellendes Ergebnis bei Arzneimitteln zu erzielen, werden die Arzneimittel durch biologische Bewertungsmethoden bewertet. Diese Methoden werden an lebenden Tieren durchgeführt, wobei lebende Organe und Gewebe, Tierpräparate und Mikroorganismen isoliert werden. Die biologischen Bewertungsmethoden für lebende Organismen werden als Bioassay oder biologischer Test bezeichnet.

Die folgende Methode wird verwendet als:

1. Entzündungshemmende Wirkung von Medikamenten

2. Antipyretische Wirkung von Medikamenten

3. Antidiabetische Aktivität von Medikamenten

4. Analgetische Wirkung von Medikamenten

5. Antiulcer Aktivität von Medikamenten

6. Anthelmintische Aktivität der Droge: Sie werden an Erdwürmern durchgeführt

7. Herzaktivität des Arzneimittels: Die Herzglykoside werden an Frosch und Taube bewertet

8. Mikrobiologische Methoden: Die lebenden Bakterien, Hefen und Schimmelpilze dienen zur Untersuchung von Vitaminen und zur Bestimmung der Aktivität von Antibiotika.

Entzündungshemmende Wirkung des Arzneimittels:

Pfotenödem-Methode:

Es werden männliche oder weibliche Sprague-Dawley-Ratten mit einem Körpergewicht zwischen 100 und 150 g verwendet. Die Tiere sind über Nacht verhungert. Um eine gleichmäßige Flüssigkeitszufuhr sicherzustellen, erhalten die Ratten 5 ml Wasser durch ein Magenröhrchen (Kontrollen) oder das Testarzneimittel, das in demselben Volumen gelöst oder suspendiert ist. Dreißig Minuten später werden die Ratten durch subkutane Injektion von 0, 05 ml einer 1% igen Lösung von Carrageen in die plantare Seite der linken Hinterpfote herausgefordert. Die Pfote ist auf Höhe des lateralen Malleolus mit Tinte markiert und bis zu dieser Markierung in Quecksilber eingetaucht.

Das Pfotenvolumen wird unmittelbar nach der Injektion plethysmographisch gemessen, wiederum 3 und 6 h und schließlich 24 h nach der Belastung. Die Zunahme des Pfotenvolumens nach 3 oder 6 Stunden wird als Prozentsatz im Vergleich zu dem unmittelbar nach der Injektion des Reizstoffs gemessenen Volumen für jedes Tier berechnet.

Effektiv behandelte Tiere zeigen viel weniger Ödeme. Die Differenz der Durchschnittswerte zwischen behandelten Tieren und Kontrollgruppen wird für jedes Zeitintervall berechnet und statistisch ausgewertet. Die Unterschiede in den verschiedenen Zeitintervallen geben Hinweise auf die Dauer der entzündungshemmenden Wirkung. Für aktive Medikamente wird eine Dosis-Antwort-Kurve erstellt und ED ₅₀ -Werte können bestimmt werden.

Wollgranulom-Methode:

Männliche Wister-Ratten mit einem Durchschnittsgewicht von 200 g werden mit Ether anästhesiert. Die Rückenhaut wird mit 70% Ethanol rasiert und desinfiziert. Im Lendenbereich wird ein Einschnitt gemacht. Durch eine abgestumpfte Zange werden subkutane Tunnel gebildet und auf beiden Seiten im Skapularbereich ein sterilisiertes Wattepellet platziert.

Die Pellets sind entweder standardisiert für die Verwendung in der Zahnmedizin mit einem Gewicht von 20 mg oder Pellets aus Rohbaumwolle, die eine stärkere Entzündung erzeugen als gebleichte Baumwolle. Die Tiere werden 7 Tage subkutan oder oral behandelt.

Dann werden die Tiere getötet, die Pellets hergestellt und getrocknet, bis das Gewicht konstant bleibt. Das Netto-Trockengewicht, dh nach Abzug des Gewichts des Baumwollpellets, wird bestimmt. Das Durchschnittsgewicht der Pellets der Kontrollgruppe sowie der Testgruppe wird berechnet. Die prozentuale Änderung des Granulomagewichts relativ zur Fahrzeugkontrollgruppe wird bestimmt.

Antipyretische Wirkung des Arzneimittels:

Es können Kaninchen beiderlei Geschlechts und verschiedener Stämme mit einem Körpergewicht zwischen 3 und 5 kg verwendet werden. Die Tiere werden in geeignete Käfige gesetzt und Thermoelemente, die mit einem automatischen Aufzeichnungsgerät verbunden sind, werden in das Rektum eingeführt. Die Tiere dürfen sich 60 min an die Käfige anpassen.

Dann werden 0, 2 ml / kg, die 0, 2 ug Lipopolysaccharid enthalten, intravenös in das Kaninchenohr injiziert. 60 Minuten später wird die Testverbindung entweder subkutan oder oral verabreicht. Die Körpertemperatur wird mindestens 3 Stunden lang überwacht.

Eine Abnahme der Körpertemperatur um mindestens 0, 5 ° C für mehr als 30 Minuten im Vergleich zum Temperaturwert vor der Verabreichung der Testverbindung wird als positiver Effekt angesehen. Dieses Ergebnis wurde nach 45 mg / kg subkutanem Phenylbutazon oder 2, 5 mg / kg Indomethacin subkutan gefunden.

Antidiabetische Aktivität von Medikamenten:

Streptozotocin-induzierter Diabetes:

Männlichen Wister-Ratten mit einem Gewicht von 150 bis 220 g, die mit einer Standarddiät gefüttert wurden, werden 60 mg / kg Streptozotocin (Calbiochem) intravenös injiziert. Wie bei Alloxan werden drei Phasen der Blutzuckeränderung beobachtet. Zunächst wird der Blutzucker erhöht und erreicht nach 3 Stunden Werte von 150-200 mg%. Sechs bis acht Stunden nach Streptozotocin sind die Insulinwerte im Serum bis zu 4-fach erhöht, was zu einer hypoglykämischen Phase führt, an die sich eine persistierende Hyperglykämie anschließt. Schweregrad und Beginn der diabetischen Symptome hängen von der Streptozotocindosis ab.

Nach der Dosis von 60 mg / kg intravenös. Symptome treten bereits nach 24-48 h auf bei Hyperglykämie bis zu 800 mg%, Glukosurie und Ketonämie. Histologisch sind die Betazellen degranuliert oder sogar nekrotisch. Ein stationärer Zustand wird nach 10 bis 14 Tagen erreicht, wodurch die Tiere für pharmakologische Tests verwendet werden können.

Alloxan-induzierter Diabetes: Kaninchen, die 2, 0 bis 3, 5 kg wiegen, werden über 150 Minuten / kg Alloxanmonohydrat (5, 0 g / 100 ml, pH 4, 5) über die Ohrvene 10 Minuten lang infundiert, was dazu führt, dass 70% der Tiere hyperglykämisch und uricosurisch werden. Die übrigen Tiere sterben entweder oder sind nur vorübergehend hyperglykämisch.

Analgetische Aktivität des Arzneimittels:

Heizplattenmethode:

Für jede Dosis werden Gruppen von 10 Mäusen beiderlei Geschlechts mit einem Anfangsgewicht von 18 bis 22 g verwendet. Die im Handel erhältliche Heizplatte besteht aus einer elektrisch beheizten Oberfläche. Die Temperatur wird auf 55 bis 56 ° C geregelt. Dies kann eine Kupferplatte oder eine beheizte Glasoberfläche sein. Die Tiere werden auf die heiße Platte gestellt, und die Zeit bis zum Lecken oder Springen wird von einer Stoppuhr aufgezeichnet. Die Latenzzeit wird vor und nach 20, 60 und 90 Minuten nach oraler oder subkutaner Verabreichung des Standards oder der Testverbindung aufgezeichnet.

Schwanz Immersionstest:

Verwendet werden junge weibliche Wister-Ratten (170-210 g Körpergewicht). Sie werden in einzelne Käfige gehalten, die den Schwanz frei hängen lassen. Die Tiere dürfen sich vor dem Test 30 Minuten lang an die Käfige anpassen. Der untere Teil von 5 cm des Schwanzes ist markiert. Dieser Teil des Schwanzes wird in eine Tasse frisch gefülltes Wasser von genau 55 ° C getaucht. Innerhalb weniger Sekunden reagiert die Ratte, indem sie den Schwanz zurückzieht. Die Reaktionszeit wird mit einer Stoppuhr in 0, 5 s-Einheiten aufgezeichnet. Nach jeder Bestimmung wird der Schwanz sorgfältig getrocknet.

Die Reaktionszeit wird vor und periodisch nach oraler oder subkutaner Verabreichung der Testsubstanz bestimmt, z. B. nach 0, 5, 1, 2, 3, 4 und 6 h. Die Abschaltzeit des Eintauchens beträgt 15 s. Die Entzugszeit unbehandelter Tiere liegt zwischen 1 und 5, 5 s. Eine Rückzugszeit von mehr als 6 s wird daher als positive Antwort betrachtet.

Heffners Schwanzclip-Methode:

Eine Arterienklemme wird an der Schwanzwurzel von Mäusen angebracht und die Reaktionszeit wird notiert. Verwendet werden männliche Mäuse (Charles-River-Stamm oder andere Stämme) mit einem Gewicht zwischen 18 und 25 g. Die Kontrollgruppe besteht aus 10 Mäusen. Die Testverbindungen werden subkutan an gefütterte Mäuse oder oral an nüchterne Tiere verabreicht. Die Testgruppen und die Kontrollgruppe bestehen aus 7-10 Mäusen.

Das Medikament wird 15, 30 oder 60 Minuten vor dem Test verabreicht. Eine Arterienklemme wird an der Schwanzwurzel (etwa 1 cm vom Körper entfernt) angebracht, um Schmerzen zu verursachen. Das Tier reagiert schnell auf diesen schädlichen Reiz, indem es in die Klemme oder den Schwanz in der Nähe der Position der Klemme beißt. Die Zeit zwischen Stimulationsbeginn und Reaktion wird von einer Stoppuhr in Schritten von 1/10 Sekunden gemessen.

Geschwür gegen Geschwüre :

Pylorusligatur bei Ratten (Shay Rat):

Weibliche Wister-Ratten mit einem Gewicht von 150-170 g sind 48 Stunden hungern und haben Zugang zu Trinkwasser nach Belieben. Während dieser Zeit werden sie einzeln in Käfigen mit erhöhten Böden aus breitem Drahtgeflecht untergebracht, um Kannibalismus und Koprophagie zu vermeiden. Pro Dosis und als Kontrolle werden zehn Tiere verwendet. Bei der Ätheranästhesie wird ein Bauchschnitt in der Mittellinie vorgenommen. Der Pylorus ist legiert, wobei darauf geachtet wird, dass das Blut nicht geschädigt wird.

Es findet keine Versorgung oder Zug am Pylorus statt. Das Greifen des Magens mit Instrumenten ist sorgfältig zu vermeiden. Andernfalls entwickeln sich Ulzerationen an solchen Stellen. Die Bauchdecke wird durch Nähte verschlossen. Die Testverbindungen werden entweder oral durch Sonden verabreicht oder subkutan injiziert.

Die Tiere werden 19 h in Plastikzylinder mit einem Innendurchmesser von 45 mm gestellt, die an beiden Enden mit Drahtgeflecht verschlossen sind. Anschließend werden die Tiere in CO ₂ -Anästhesie getötet. Der Bauch wird geöffnet und eine Ligatur um den Ösophagus in der Nähe des Zwerchfells platziert.

Der Magen wird entfernt und der Inhalt wird in einem Zentrifugenröhrchen abgelassen. Entlang der größeren Krümmung wird der Magen geöffnet und auf einer Korkplatte festgesteckt. Die Mukosa wird mit einem Stereomikroskop untersucht. Bei der Ratte bilden die oberen zwei Fünftel des Magens den Pansen mit Plattenepithel und besitzen wenig Schutzmechanismen gegen die ätzende Wirkung von Magensaft.

Unterhalb eines Begrenzungskamms im Drüsenbereich des Magens sind die Schutzmechanismen in der Schleimhaut der mittleren zwei Fünftel des Magens besser als im untersten Teil und bilden den Antrum.

Daher treten Läsionen hauptsächlich im Pansen und im Antrum auf. Die Anzahl der Geschwüre wird notiert und der Schweregrad mit den folgenden Werten erfasst:

. 0 = kein Geschwür

. 1 = oberflächliche Geschwüre

. 2 = tiefe Geschwüre

. 3 = Perforation.

Das Volumen des Mageninhalts wird gemessen. Nach der Zentrifugation wird die Acidität durch Titration mit 0, 1 n NaOH bestimmt.

Auswertung:

Eine Ulkusindex-Benutzeroberfläche wird berechnet:

UI = UN + US + UP x 10-1

ich. UN = Durchschnitt der Anzahl der Geschwüre pro Tier

ii. US = Durchschnitt der Bewertung des Schweregrads

iii. UP = Prozentsatz der Tiere mit Geschwüren

Ulkusindex und Acidität des Mageninhalts der behandelten Tiere werden mit den Kontrollen verglichen. Mit verschiedenen Dosen können Dosis-Antwort-Kurven für die Bildung von Geschwüren und die Magensäuresekretion erstellt werden. ID50-Werte können durch eine Probity-Analyse berechnet werden, wobei 0% Nein und 100% maximal stimulierte Magensäureausgabe entspricht.

Stressgeschwür durch Immobilisierungsstress:

Es werden Gruppen von 10 weiblichen Wister-Ratten pro Dosis des Testarzneimittels und für Kontrollen mit einem Gewicht von 150-170 g verwendet. Nahrung und Wasser werden 24 Stunden vor dem Experiment entnommen. Nach oraler oder subkutaner Verabreichung der Testverbindung oder der Placebo-Lösung werden die Tiere mit Ether leicht betäubt.

Sowohl die unteren als auch die oberen Extremitäten sind miteinander verbunden und die Tiere sind mit Drahtblick umwickelt. Sie werden 24 Stunden bei 20 ° C horizontal im Dunkeln aufgehängt und schließlich in einer CO ₂ -Anästhesie getötet. Der Magen wird entfernt, auf einer Korkplatte fixiert und die Anzahl und der Schweregrad der Geschwüre werden mit einem Stereomikroskop unter Verwendung der folgenden Werte erfasst:

.0 = kein Geschwür

.1 = oberflächliche Geschwüre

.2 = tiefe Geschwüre.

.3 = Perforation

Auswertung

Eine Ulkusindex-Benutzeroberfläche wird berechnet:

UI = UN + US + UP x 10-1

UN - Durchschnitt der Anzahl der Geschwüre pro Tier.

US = Durchschnitt der Bewertung des Schweregrads.

UP - Prozentsatz der Tiere mit Geschwüren