Urease-Test an Bakterien, um ihre Fähigkeit zur Hydrolyse von Harnstoff zu ermitteln (mit Abbildung)

Urease-Test an Bakterien, um herauszufinden, ob sie Harnstoff hydrolysieren können (mit Abbildung)!

Prinzip:

Einige Bakterien haben die Fähigkeit, Harnstoff zu NH ₃ und CO ₂ zu hydrolysieren (Abbau in Gegenwart von Wasser), da sie das Enzym "Urease" bilden können.

NH ₃ ist alkalisch (basisch), wodurch es den pH-Wert erhöht und die Farbe von Phenolrot von gelb nach rosa ändert.

Bei dem Urease-Test werden die Testbakterien auf Agarschrägen gezüchtet, die Harnstoff und Phenolrot enthalten. Wenn die Bakterien die Fähigkeit haben, Harnstoff zu hydrolysieren, ändert sich die Farbe des Mediums von gelb nach rosa. Einige Bakterien können NH _{3 produzieren,} indem sie die Peptone im Medium abbauen. In solchen Fällen wird ein falsch positives Ergebnis erzielt.

Erforderliche Materialien:

Reagenzgläser, Erlenmeyerkolben, Wattestopfen, Impfnadel, Autoklav, Bunsenbrenner, Laminar-Flow-Kammer, Entsorgungsgefäß, Inkubator, Membranfiltrationsapparat, Harnstoffagar, isolierte Kolonien oder Reinkulturen von Bakterien.

Verfahren:

1. Fünf Reagenzgläser sind mit Baumwolle verstopft, mit Bastelpapier bedeckt und mit Faden oder Gummiband zusammengebunden (Abbildung 7.15).

2. Die für 100 ml des Mediums erforderlichen Bestandteile des Harnstoffagarmediums (das Harnstoff als Hauptkomponente enthält) oder seines gebrauchsfertigen Pulvers (außer Harnstoff) werden abgewogen und in 90 ml destilliertem Wasser in einem 250-ml-Erlenmeyerkolben gelöst zittern und wirbeln.

3. Sein pH-Wert wird unter Verwendung eines pH-Papiers oder eines pH-Meters bestimmt und mit 0, 1 N HCl auf 6, 9 eingestellt, wenn es mehr ist, oder mit 0, 1 N NaOH, wenn es weniger ist.

4. Der Kolben wird erhitzt, um den Agar vollständig in dem Medium aufzulösen.

5. Der Kolben ist mit Baumwolle verstopft, mit Bastelpapier bedeckt und mit Faden oder Gummiband gebunden.

6. Die fünf Teströhrchen und der Harnstoffagar enthaltende Erlenmeyerkolben (außer Harnstoff) werden bei 121 ° C (15 psi Druck) 15 Minuten in einem Autoklaven sterilisiert.

7. Nach der Sterilisation werden sie aus dem Autoklaven genommen und einige Zeit abkühlen gelassen, ohne dass sich das Medium verfestigt. Die Kühlung des Mediums verhindert die Kondensation und Ansammlung von Wassertröpfchen auf den Schrägen. Wenn das Medium bereits während der Lagerung hergestellt und verfestigt wurde, muss es durch vorsichtiges Erhitzen verflüssigt werden, bis es vollständig schmilzt.

8. Eine 20% ige Harnstofflösung wird durch Auflösen von 20 g Harnstoff in 100 ml destilliertem Wasser hergestellt und durch eine Membranfiltrationsvorrichtung sterilisiert, da Harnstoff nicht durch Hitze sterilisiert werden kann, da er sich beim Erhitzen zersetzt.

9. 10 ml der sterilisierten Harnstofflösung werden aseptisch gründlich mit 90 ml des sterilisierten gekühlten verflüssigten Mediums (durch Erhitzen verflüssigt) gemischt.

10. Bevor es sich verfestigt, wird das Medium in warmem geschmolzenem Zustand aseptisch in die 5 mit Watte verschlossenen, sterilisierten Reagenzgläser (jeweils etwa 20 ml) verteilt.

11. Die Teströhrchen werden in einer schrägen Position gehalten, um das Medium abzukühlen und zu verfestigen, um Harnstoffagar-Schrägen zu erhalten.

12. Die Testbakterien werden aseptisch, vorzugsweise in einer Laminar-Flow-Kammer, in die Schrägen inokuliert, indem sie in den Kolben stechen und mit Hilfe einer flammensterilisierten Nadel auf der Oberfläche der Schrägen streifen. Die Nadel wird nach jeder Impfung sterilisiert.

13. Die inokulierten Schrägen werden 24 Stunden in einem Inkubator bei 37 ° C inkubiert.