Transgene Tiere: Ziele des Gentransfers mit verschiedenen Transfektionsmethoden
Transgene Tiere: Ziele des Gentransfers mit verschiedenen Transfektionsmethoden!
Ein transgenes Tier enthält in seinem Genom ein Gen oder Gene, die durch die eine oder andere Transfektionstechnik eingeführt werden.
Das durch Transfektion eingeführte Gen wird als Transgen bezeichnet. Bei Tieren bedeutet Transfektion die Einführung eines DNA-Segments, entweder nackt oder in einen Vektor integriert, in eine Tierzelle.
Ziele des Gentransfers:
1. Die genetische Veränderung von Tieren kann darauf abzielen, die Produktion von Milch, Fleisch, Wolle usw. zu verbessern.
2. Es wurden Gene in Tiere übertragen, um eine Produktion der von diesen Genen codierten Proteine in Milch, Urin oder Blut dieser Tiere in großem Maßstab zu erhalten.
3. Ein spezieller Fall des Gentransfers zielt darauf ab, die Symptome und das daraus resultierende Elend genetisch bedingter Krankheiten zu lindern oder sogar zu beseitigen. Bei diesem Ansatz werden normale und funktionelle Kopien des defekten Gens in den Patienten eingeführt (Gentherapie).
4. Spezifische transgene Tierstämme oder -linien werden geschaffen, um spezielle experimentelle und / oder biomedizinische Bedürfnisse zu erfüllen.
Transfektionsmethoden:
Für die Einführung von DNA in Tierzellen / Embryonen wurden verschiedene Ansätze verwendet, die wie folgt sind:
(i) Calciumphosphatfällung.
(ii) direkte Mikroinjektion.
(iii) Retrovirusinfektion.
(iv) Lipofektion.
(v) Lieferung von Partikelkanonen und
(vi) Elektropoiation.
Calciumphosphat-Niederschlag:
Bei diesem Ansatz wird das zur Transfektion zu verwendende DNA-Präparat zunächst in einem Phosphatpuffer gelöst. Die Calciumlösung wird dann zu der DNA-Lösung gegeben. Dies führt zur Bildung von unlöslichem Calciumphosphat, das zusammen mit der DNA ausfällt. Der Calciumphosphat-DNA-Niederschlag wird den zu transfizierenden Zellen zugesetzt.
Die Präzipitatpartikel werden von den Zellen durch Phagozytose aufgenommen. Anfangs wurden 1-2% der Zellen auf diese Weise transfiziert. Das Verfahren wurde nun jedoch modifiziert, um eine Transfektion von bis zu 20% der Zellen zu erreichen. In einem kleinen Teil der transfizierten Zellen wird die DNA in das Zellgenom integriert, wodurch eine stabile oder dauerhafte Transfektion erzeugt wird.
Dieser allgemeine Ansatz kann auf praktisch alle Säugetierzellen angewendet werden, und eine sehr große Anzahl von Zellen kann mit geringem Aufwand behandelt werden. Viele Zelllinien mögen jedoch nicht, dass der Calciumphosphat-Niederschlag an seinen Oberflächen oder an seinem Substrat haftet.
Lipofektion:
Die Abgabe von DNA in Zellen unter Verwendung von Liposomen wird Lipofektion genannt. Liposomen sind kleine Vesikel, die aus einem geeigneten Lipid hergestellt werden. Anfangs wurden nichtionische Lipide zur Herstellung von Liposomen verwendet, so dass DNA nach spezifischen Verkapselungsverfahren in die Vesikel eingeführt werden musste.
Die Verwendung kationischer Lipide zum Aufbau von Liposomen ist ein deutlicher Vorteil, da DNA spontan und effizient mit diesen Liposomen komplexiert, wodurch Einkapselungsverfahren nicht erforderlich sind. Die kationischen Liposomen haben eine einzige Lipid-Doppelschichtmembran (unilamellar) und binden effizient an die Zellen. Vermutlich verschmelzen sie mit der Plasmamembran und transportieren dabei die DNA (mit ihnen komplexiert) in die Zellen, was die Transfektion bewirkt.
Die Lipofektion ist die Methode der Wahl für die Transfektion von Säugerzellen in vitro. Es wurde auch verwendet, um DNA durch direkte Injektion oder intravenöse Injektion in lebende Tiere abzugeben. Kationische Liposomen wurden zur intravenösen oder intratrachealen Injektion in Mäuse zur Expression von Markergenen in der Lunge verwendet. Die zielgerichtete Abgabe wurde auch durch den Einbau spezifischer Ligandenproteine in die Liposomenmembranen demonstriert.
Retrovirale Infektion:
Rekombinante Retroviren produzieren Virionen, die zur Infektion von Tierzellen und Mäuseembryonen verwendet werden. Das rekombinante Retrovirus-RNA-Genom wird durch reverse Transkriptase kopiert, um eine DNA-Kopie (Umsatztranskription) zu erhalten, die in das Genom der Zelle integriert wird. Die Reverse Transkriptase wird vom Retrovirus codiert und wird unmittelbar nach der Infektion produziert.
Die reverse Transkription kann jedoch nur in solchen Zellen vorkommen, die die S-Phase durchlaufen, dh mitotisch aktiv sind. Die DNA-Kopie des rekombinanten Retrovirus wird an zufälligen Stellen in das zelluläre Genom integriert und ist normalerweise nicht mit Deletionen oder Umlagerungen verbunden.
Mikroinjektion:
Bei diesem Verfahren wird die DNA-Lösung direkt in den Zellkern einer Zelle oder in den männlichen Vorkern eines befruchteten ein- bis zweizelligen Eies injiziert. Typischerweise besteht eine Mikroinjektionsanordnung aus einem stereoskopischen Mikroskop mit geringer Leistung (um das Ei und den gesamten Prozess zu betrachten) und zwei Mikromanipulatoren, einer für eine Glasmikropipette, um die Eizelle durch partielles Ansaugen zu halten, und der andere für eine Glasinjektionsnadel zum Einführen der DNA in den männlichen Pronukleus. Der männliche Pronukleus ist viel größer als der weibliche Pronucleus befruchteter Säugereier. In Fischeiern wird die DNA jedoch in das Eizytoplasma injiziert.
Das allgemeine Verfahren für die Mikroinjektion ist wie folgt: Spenderfrauen werden durch geeignete Hormonbehandlungen zum Super-Ovulat induziert. Die superovulierten Weibchen werden dann mit fruchtbaren Männchen gepaart und eine große Anzahl befruchteter ein- oder zweizelliger Eizellen / Embryos wird operativ gesammelt. Alternativ werden unbefruchtete Eizellen von superovulierten Weibchen gesammelt. Die Eizellen werden dann in vitro befruchtet. Das Transgenkonstrukt wird in einer Pufferlösung hergestellt und mittels einer Mikroinjektionsanordnung in männliche Pronuctei von befruchteten Eiern injiziert.
