Fortschritte in der Diagnostik von Malaria

Fortschritte in der Diagnostik von Malaria - HL Gupta, VK Talwar, A Rohtagi!

Einführung:

In Indien ist Malaria ein großes Gesundheitsproblem. In Rajasthan und den Nordoststaaten kam es häufig zu Ausbrüchen. In der Inzidenz von Rajasthan nimmt P. falciparum zu. In Delhi ist P. vivax die häufigste Art, aber auch P. falciparum ist anzutreffen. Malaria, ein weltweites Problem, tötet jedes Jahr zwischen 1, 5 und 2, 7 Millionen Menschen. Mit anderen Worten, es tötet alle 12 Sekunden eine Person (oft ein Kind <5 Jahre). Darüber hinaus infizieren sich jedes Jahr 300 bis 500 Millionen Menschen mit der Krankheit.

Für die Kontrolle von Krankheiten ist eine schnelle und genaue Diagnose von größter Bedeutung. Die Malaria-Diagnose wird häufig nur aufgrund klinischer Symptome gestellt, die Genauigkeit liegt jedoch bestenfalls bei 50 Prozent. Neuere, fortgeschrittene Diagnosetechniken sind jetzt verfügbar. Kürzlich eingeführte Untersuchungen, die auf einem Immunoassay basieren, sind schnell (<10 min / Test) und mindestens so empfindlich wie die herkömmliche Mikroskopie.

Lichtmikroskopie: Dicke und dünne Blutabstriche:

Das traditionell akzeptierte Laborverfahren zur Diagnose von Malaria ist die mikroskopische Untersuchung von Giemsa- oder Field-angefärbten Blutabstrichen. Idealerweise sollte das Blut durch einen Fingerstich gewonnen werden. Blut, das durch Venenpunktion und Antikoagulans (EDTA oder Heparin) gewonnen wird, ist jedoch bei sofortiger Untersuchung akzeptabel. Es sollten sowohl dicke als auch dünne Abstriche gemacht werden. Dicker Abstrich, konzentriert rote Zellen 20 - 30 Mal auf einer kleinen Oberfläche, erhöht die Empfindlichkeit der Technik und ist viel besser als dünne Abstriche. Ein dünner Abstrich ist jedoch spezifischer.

Es ist der anerkannte Goldstandard für die Diagnose, ist jedoch arbeitsintensiv und die Interpretation der Ergebnisse erfordert insbesondere bei geringer Parasitämie beträchtliche Fachkenntnisse. Außerdem können P falciparum-Parasiten, die häufig vom peripheren Blut abgesondert werden, leicht übersehen werden.

Quantifizierung von Parasiten durch Untersuchung von Blutabstrichen:

Es gibt viele Methoden, um Malariaparasiten in dicken Abstrichen zu quantifizieren. Die Parasitenspiegel können auch durch Untersuchung eines dünnen Blutausstrichs quantifiziert werden. Ein großer Nachteil von dicken Abstrichen ist, dass häufig ein gewisses Maß an Fachwissen erforderlich ist, das möglicherweise nicht verfügbar ist.

Theoretisch sollte der Prüfer Dickstrichfelder zählen, die 20 oder mehr Leukozyten / hpf enthalten. Tatsächlich sind Felder, die 20 oder mehr Leukozyten enthalten, zu dick, um gezählt zu werden, während Felder, die am einfachsten zu lesen sind, solche sind, die nur fünf oder sechs Leukozyten / hpf enthalten.

Vor der Färbung sollte der Prüfer in der Lage sein, den Druck durch einen gut vorbereiteten, dicken Blutausstrich zu lesen. Die Untersuchung dünner Abstriche ist nur ein Zehntel so empfindlich wie die Untersuchung dicker Abstriche. Obwohl die Untersuchung von Blutausstrichen als universeller "Goldstandard" akzeptabel ist, gibt es tatsächlich keine einheitliche Standardmethode, die von allen Forschern zur Quantifizierung von Parasiten verwendet wird, indem Parasiten in dicken Abstrichen gezählt werden.

Darüber hinaus schränkt das Fehlen von Mikroskopen bei geschultem Personal die Nützlichkeit der Blutausstrichuntersuchung in vielen endemischen Gebieten ein. In Anerkennung dieser Einschränkungen wurden alternative Techniken zur Diagnose von Malaria entwickelt.

Fluoreszenzmikroskopie:

Drei fluoreszierende Techniken versprechen die Diagnose von Malaria.

Diese sind:

(i) Das quantitative Buffy-Coat-Verfahren (OBC), das als handelsübliches Kit erhältlich ist

(ii) das Kawamoto Acridine Orange (AO) -Verfahren und

(iii) Benzothiocarboxypurin (BCP) -Verfahren.

Diese drei Techniken sind schnell und einfach auszuführen. Wenn es mehr als 100 Parasiten / µl gibt, zeigen sie eine Sensitivität und Spezifität, die denen der Dickabstrichuntersuchung entspricht.

Sowohl die OBC- als auch die Kawamoto-Methode verwenden Acridine Orange (AO) als Fluorochrom, um die Nukleinsäuren von Malariaparasiten in einer Probe zu färben. BCP ist auch ein Fluorochrom, das Nukleinsäuren anfärbt. AO ist unspezifisch und färbt Nukleinsäuren von allen Zelltypen.

Folglich muss der Untersucher lernen, fluoreszierend gefärbte Parasiten von anderen Zellen und Zelltrümmern zu unterscheiden. Die Sensitivität der AO-Färbung mit Parasitenkonzentrationen von weniger als 100 Parasiten / µl betrug 41, 7-93%.

Die Spezifität der AP-Färbung für P. vivax und P. falciparum beträgt 52 bzw. 93 Prozent. Die BCP-Methode hat eine Sensitivität und Spezifität von mehr als 90 Prozent. Eine wichtige Einschränkung der auf AO und BCP basierenden Methoden ist ihre Unfähigkeit, zwischen Plasmodium-Arten zu unterscheiden. AO ist gefährlich und erfordert besondere Anforderungen an die Entsorgung.

OBC und das BCP sind technisch anspruchsvoller als Kawamoto. Kawamoto- und AO-Verfahren erfordern spezielle Ausrüstung und Vorräte und sind teurer. Der Preis eines Fluoreszenzmikroskops kann ein limitierender Faktor für Laboratorien sein, die an diesen Methoden interessiert sind.

Nachweis spezifischer Nukleinsäuresequenzen:

Der Nachweis von Nukleinsäuresequenzen, die für Plasmodium-Parasiten spezifisch sind, kann nützlich sein. Bei PCR-basierten Techniken wird die amplifizierte Zielsequenz durch interne Sonden nachgewiesen oder durch Gelelektrophorese analysiert. Ein großer Vorteil der Verwendung einer PCR-basierten Technik ist die Fähigkeit, eine geringe Parasitämie zu erkennen. Infektionen mit lebenden Parasiten können mit einer Spezifität von 100 Prozent nachgewiesen werden.

Solche Techniken sind jedoch teuer und arbeitsintensiv, erfordern umfangreiches technisches Fachwissen, umfassen mehrere Schritte und können nicht verwendet werden, um zwischen lebensfähigen und nicht lebensfähigen Organismen zu unterscheiden.

In Blutproben natürlich vorkommende PCR-Inhibitoren können zu einer erheblichen Anzahl falsch negativer Ergebnisse führen. Es wurden auch falsch positive Ergebnisse aufgrund von Verschleppung mitgeführt.

PCR-basierte Techniken wurden verwendet, um Spender in einem Gebiet zu untersuchen, in dem Malaria endemisch ist. Die Sensitivität und Spezifität von PCR-basierten Methoden, die anhand von Blutabstrichen als "Goldstandard" geschätzt werden, beträgt jeweils 90% oder mehr.

Darüber hinaus können weitere Fortschritte in der PCR-Technologie bald dazu führen, dass lebende Parasiten von nicht lebensfähigen unterschieden werden können. Gegenwärtig ist der Nutzen einer solchen Technologie durch den Bedarf an teuren, spezialisierten Laborgeräten, an genetischen Technologien und an Reinraumeinrichtungen geschultem Personal und an hohen Kosten für verwendete Enzyme und Primer begrenzt.

Antigen-Erkennung:

Tests zum Nachweis von Antikörpern gegen Malaria waren in ihrer Empfindlichkeit und ihrer Fähigkeit, aktive Infektionen von früheren Infektionen zu unterscheiden, begrenzt. Antigen-Capture-Tests der neuen Generation sind in der Lage, weniger Parasiten zu erkennen und schnelle Ergebnisse zu erzielen (10-15 Minuten). Es handelt sich um handelsübliche Kits, die alle erforderlichen Reagenzien enthalten und keine umfangreiche Schulung oder Ausrüstung erfordern.

In den neuen, schnellen diagnostischen Tests werden zwei Parasitenantigene verwendet, das Histidin-reiche Protein-2 (HRP-2), das nur von P. falciparum produziert wird, und das Parasit-Lactat-Dehydrogenase-Antigen (pLDH), das von allen vier produziert wird Plasmodium-Arten, die den Menschen befallen. Beide Antigene werden durch alle asexuellen Stadien des Parasiten ins Blut ausgeschieden; Das pLDH-Antigen wird auch von Gametozyten produziert.

Die neuesten Antigen-Capture-Tests sind schnell und einfach durchzuführen und weisen Nachweisgrenzen auf, die mit denen einer qualitativ hochwertigen Mikroskopie vergleichbar sind (z. B. 100-200 Parasiten / µl). Bei mehr als 60-100 Parasiten / µl liegt die HRP- 2 basierte Tests sind hoch (> 90%) empfindlich und (> 90%) spezifisch im Vergleich zur Dickschmiermikroskopie.

Derzeit sind zwei solcher Tests im Handel erhältlich, der ParaSight F-Test und der ICT-Malaria-Pf (Test). Beide Tests werden an Stichproben durchgeführt und erfassen nur die Malaria von P. falciparum.

Sie basieren auf monoklonalen Antikörpern gegen HRP-2, die auf Nitrocellulosestreifen zur Herstellung von Teststreifen oder Pappetests (ICT-Pf-Test) immobilisiert sind. Bei jedem Test wird ein positives Ergebnis durch das Auftreten einer roten Linie auf dem Teststreifen angezeigt, an der die monoklonalen Antikörper immobilisiert sind.

Beide Tests enthalten auch eine integrierte Steuerung; Eine Kontrolllinie muss erscheinen, damit ein Test als gültig betrachtet wird. Sensitivität und Spezifität des ParaSight F-Tests sind mit 88 bzw. 97 Prozent vergleichbar mit der PCR.

Obwohl serologische Tests auf HRP-2-Basis eine rasche Diagnose von Malaria falciparum zulassen, sind sie nur bedingt brauchbar. Da HRP-2 nur in P. falciparum vorhanden ist, sind Tests, die auf dem Nachweis von HRP-2 basieren, mit einer durch Vivax, Ovale oder Malaria verursachten Infektion negativ.

Viele Fälle von Nicht-Falciparum-Malaria werden daher als Malaria-negativ diagnostiziert. Eine weitere Einschränkung der auf HRP-2 basierenden Tests ist, dass HRP-2 lange nach dem Verschwinden der klinischen Symptome im Blut persistiert und die Parasiten anscheinend aus dem Wirt entfernt werden.

In der Tat wurde HRP-2 in Mumien entdeckt. Tests auf dieses Antigen sind daher möglicherweise nicht für das Screening der in Endemiegebieten lebenden Menschen geeignet, die an einer dauerhaften, niedrigen Parasitämie leiden können. Der mögliche Grund für die Persistenz von HRP-2-Antigen ist nicht gut verstanden; es kann das Vorhandensein latenter, lebensfähiger Parasiten (möglicherweise ein Ergebnis eines Behandlungsversagens) oder von löslichen Antigen-Antikörper-Komplexen widerspiegeln.

Die Persistenz kann auch von der Art der eingesetzten Malariatherapie abhängen. Das HRP-2-Signal kann nach scheinbar wirksamer Chinin- und Doxycyclin-Therapie für 19 Tage bestehen bleiben. Während und nach der Artemether-Therapie wurde auch eine persistierende HRP-2-Antigenämie beobachtet.

Andere Einschränkungen beziehen sich speziell auf technische Aspekte des HRP-2-Systems. Beispielsweise kann im ParaSight F-System verwendetes monoklonales IgG mit dem Rheumafaktor kreuzreagieren und eine falsch positive Reaktion verursachen.

Der ICT-Pf-Test verwendet ein monoklonales IgM, das nicht kreuzreagiert, und es gibt keine Berichte über falsch positive Reaktionen, die bei diesem Test aufgrund eines Rheumafaktors auftreten. Der ICT-Pf-Test erfordert jedoch eine Lagerung bei 4 ° C, was seine Nützlichkeit unter Feldbedingungen einschränkt.

pLDH-basierte serologische Assays:

Die neuesten serologischen Schnelltests zur Diagnose von Malaria basieren auf dem Nachweis von pLDH. Wie bei HRP-2-basierten Tests sind diese Tests empfindlich, spezifisch und leicht durchzuführen. Die Ergebnisse sind in weniger als 15 Minuten erhältlich.

Die auf pLDH basierenden Assays können auch zwischen P. falciparum und anderen Plasmodium-Arten unterscheiden. Da pLDH nur von lebenden Parasiten produziert wird, eignen sie sich auch zur Überwachung der Malaria-Therapie. pLDH aus P. falciparum unterscheidet sich von Wirts-LDH (h-LDH) mit 3-Acetylpyridin-Adenin-Dinukleotid (APAD), einem Analogon des Nicotinamid-Adenin-Dinukleotids (NAD).

Die auf pLDH basierenden Assays sind in zwei Formen erhältlich: einem semi-quantitativen, trockenen Peilstab (OptiMAL); und einen quantitativen immunenzymatischen Capture-Assay. Der OptiMAL-Test verwendet zwei monoklonale Antikörper, von denen einer spezifisch für P. falciparum ist und der andere alle 4 Plasmodien erkennt.

Die getestete Blutprobe (10 µl Fingerprick, Vollblut oder gefrorenes Hämolysat) wird mit 30 µl Lysierpuffer gemischt, der konjugierten monoklonalen Antikörper enthält. Diese Mischung kann in den OptiMAL-Messstab eindringen.

Nach 3 Minuten werden 100 ul Clearing-Puffer zugegeben. Wenn P. falciparum in der Blutprobe vorhanden ist, entstehen auf den Messstäbchen drei Linien (darunter eine, die die positive Kontrolle darstellt).

Zwei Zeilen zeigen P. vivax, P. malariae oder gelegentlich P. ovale an. Ein neu formatierter OptiMAL-2-Streifen verfügt über drei Testlinien und eine positive Kontrolllinie, mit der alle vier Plasmodium-Arten identifiziert werden können.

Jeder Test wird nur dann als ualid betrachtet, wenn sich eine Kontrolllinie entwickelt. Die im OptiMAL-Test verwendeten monoklonalen Antikörper wurden eingehend auf Kreuzreaktivität mit LDH aus Leishmanien, Babesien und pathogenen Bakterien oder Pilzen getestet, und es wurde kein Hinweis auf eine solche Kreuzreaktivität gefunden.

Es wurde festgestellt, dass HRP-2 nach der Beseitigung der peripheren Parasitämie gut persistiert. Obwohl die pLDH-Spiegel eng auf die periphere Parasitämie einwirken und 3-5 Tage nach der Behandlung mit Chinin und Doxycyclin auf nicht nachweisbare Werte fielen, fielen die HRP-2-Antigen-Spiegel erst nach 19 Tagen ab, und der Patient ist Symptom und scheinbar frei von Parasiten.

Der OptiMAL-Test sollte daher ein wertvolles Instrument zur Überwachung der Malaria-Therapie sein. Die Clearance von Parasitämie und die Clearance von pLDH scheinen sich parallel zu befinden.

OptiMAL-Assays sind sehr vielseitig. Der OptiMAL-Test weist im Vergleich zu Blutausstrichen Empfindlichkeiten von 94 - 88% und eine Spezifität von 100% und 99% für P. vivax bzw. P. falciparum auf.

Dieser Test kann als epidemiologisches Hilfsmittel verwendet werden, da er in Gebieten, in denen mehr als eine Plasmodium-Art im Umlauf ist, dazu verwendet werden kann, die Plasmodium-Arten, die Patienten in jedem Dorf infizieren, schnell zu identifizieren und den Beschäftigten des öffentlichen Gesundheitswesens die geeignetste Chemotherapie zur Verfügung stellen kann .

Schlussfolgerungen:

In den letzten Jahren haben Bemühungen, das traditionelle und langwierige Ablesen von Blutausstrichen (eine vor fast 100 Jahren entwickelte Methode) zu ersetzen, zu Techniken zum Nachweis von Malariaparasiten geführt, die Sensitivitäten ergeben, die der Mikroskopie entsprechen oder besser sind als diese.

Obwohl PCR-basierte Methoden wohl am empfindlichsten sind, sind sie so teuer und benötigen eine solche spezielle Ausrüstung und Schulung, dass sie in den meisten Entwicklungsländern unwahrscheinlich für Routinediagnosen eingesetzt werden.

Sie sind besonders nützlich für Studien über Stammdifferenzen, Mutationen und Gene, die an der Medikamentenresistenz des Parasiten beteiligt sind, und um den Grad der Verwandtschaft zwischen Stämmen zu zeigen, die mit verschiedenen Malariaausbrüchen assoziiert sind. Die vielversprechendsten neuen Malariadiagnostika sind die serologischen Teststreifen.

Diese Tests, einschließlich ParaSight F, ICT Pf Test und OptiMAL, sind einfach zu verwenden, leicht zu interpretieren und liefern Ergebnisse innerhalb von 15 Minuten oder weniger. Diese Tests sind fast so empfindlich wie die mikroskopische Untersuchung von Blutausstrichen, erfordern jedoch kein hochqualifiziertes Personal, um die Ergebnisse durchzuführen oder zu interpretieren.

Der OptiMAL-Test bietet den zusätzlichen Vorteil, dass er alle vier Plaspiodium-Arten nachweisen kann und die Wirksamkeit der medikamentösen Therapie verfolgen kann, da er ein Enzym misst, das nur von lebenden Parasiten produziert wird.

Obwohl die Teststreifen zwei offensichtliche Einschränkungen haben, sollte keiner der Tests verhindern, dass sie allgemein akzeptiert werden. Die erste Einschränkung ist die Empfindlichkeit. Die drei derzeit auf dem Markt befindlichen Assays haben Empfindlichkeitsschwellen von 50-100 Parasiten / µ1. Die Empfindlichkeit für Proben mit <50 Parasiten / µl beträgt konstant 50% -70%.

Dieses Empfindlichkeitsniveau stellt für diejenigen, die dauerhaft in endemischen Gebieten leben, die oft nicht behandelt werden, kein großes Problem dar, es sei denn, sie haben mehr als 500 Parasiten / µl Blut, können jedoch ein Problem bei der Diagnose von Malaria darstellen sind aus nicht endemischen Gebieten, leben aber in endemischen Gebieten.

Da jedoch die überwiegende Mehrheit der Malariapatienten Parasitenkonzentrationen aufweist, die weit über 50 Parasiten / µl liegen, würden nur wenige Patienten falsch diagnostiziert werden, wenn die Teststreifen routinemäßig verwendet würden. Die zweite Einschränkung dieser Tests sind zumindest derzeit ihre Kosten.

Die Weltgesundheitsorganisation ist der Auffassung, dass Diagnosetests für Malaria weniger als 0, 40 US-Dollar pro Probe kosten sollten, wenn sie in endemischen Gebieten davon profitieren sollten. Wenn die Teststreifen nicht in großen Stückzahlen produziert werden, ist dieser Preis für die Hersteller unerreichbar und nicht praktikabel.

Die aktuellen Kosten der Teststreifen hängen von dem Standort des Käufers und dem bestellten Volumen ab. Zum Beispiel liegen die Kosten der ICT-Pf-Tests in Entwicklungsländern zwischen 1, 30 USD / Test. Der Para 0Sight F-Test kostet 1, 20 US-Dollar / Test. Der optiMAL-Streifen wird derzeit für 3, 00 US-Dollar / Test verkauft.