Oxidasetest an Bakterien, um herauszufinden, ob sie in der Lage sind, reduziertes Cytochrom C zu oxidieren

Lesen Sie diesen Artikel, um mehr über den Oxidasetest an Bakterien zu erfahren, um herauszufinden, wie sie reduziertes Cytochrom C oxidieren können:

Prinzip:

Einige Bakterien haben die Fähigkeit, "reduziertes Cytochrom C" in ihren Zellen zu "oxidiertem Cytochrom C" zu oxidieren, da sie das Enzym "Cytochromoxidase" produzieren können.

Das oxidierte Cytochrom C erzeugt mit dem Farbstoff N-Tetramethyl-para-phenylendiamin (dh Oxidase-Reagens) eine violette Farbe (Wurster-Purpur).

Im Oxidasetest werden Nähragarplatten, die die Kolonien der Testbakterien enthalten, mit der Lösung des Oxidase-Reagens geflutet. Wenn die Bakterien die Fähigkeit haben, das Enzym Cytochromoxidase zu produzieren, ändert sich die Farbe der Kolonien auf den Platten in Purpur. Wenn die Bakterien keine Cytochromoxidase produzieren können, behalten die Kolonien die ursprüngliche rosa Farbe des Oxidase-Reagens bei.

Erforderliche Materialien:

Petrischalen, Erlenmeyerkolben, Wattestäbchen, Platindraht-Impföse, Autoklav, Bunsenbrenner, Laminar-Flow-Kammer, Entsorgungsglas, Inkubator, Whatman-Filterpapierstreifen, Oxidase-Reagenz (N-Tetramethyl-para-phenylendiamin), Nährkolben oder isolierte Kolonien Reinkulturen von Bakterien.

Verfahren:

(a) Plattenmethode:

1. Zwei Petrischalen werden gereinigt, mit Kraftpapier abgedeckt und mit Faden oder Gummiband zusammengebunden (Abbildung 7.19). Diese Schritte sowie die Sterilisation der Petrischalen in Schritt 6 entfallen, wenn ofensterilisierte Petrischalen direkt verwendet werden.

2. Die für 100 ml des Mediums erforderlichen Bestandteile des Nähragarmediums oder seines Fertigpulvers werden abgewogen und in 100 ml destilliertem Wasser in einem 250-ml-Erlenmeyerkolben durch Schütteln und Verwirbeln gelöst.

3. Sein pH-Wert wird unter Verwendung eines pH-Papiers oder eines pH-Meters bestimmt und unter Verwendung von 0, 1 N HCl auf 0, 1 eingestellt, wenn weniger als 0, 1 N NaOH verwendet wird.

4. Der Kolben wird erhitzt, um den Agar vollständig in dem Medium aufzulösen.

5. Der Kolben ist mit Baumwolle verstopft, mit Bastelpapier bedeckt und mit Faden oder Gummiband gebunden.

6. Die zwei Petrischalen und der konische Kolben, der Nähragarmedium enthält, werden bei 121 ° C (15 psi Druck) 15 Minuten in einem Autoklaven sterilisiert.

7. Nach der Sterilisation werden sie aus dem Autoklaven genommen und einige Zeit abkühlen gelassen, ohne dass sich das Medium verfestigt. Die Kühlung des Mediums verhindert die Kondensation und Ansammlung von Wassertropfen in den Platten. Wenn das Medium bereits während der Lagerung hergestellt und verfestigt wurde, muss es durch vorsichtiges Erhitzen verflüssigt werden, bis es vollständig schmilzt.

8. Um Nähragarplatten herzustellen, bevor das sterilisierte Nähragarmedium sich abkühlt und verfestigt, wird es in warmem geschmolzenem Zustand aseptisch, vorzugsweise in einer Laminar-Flow-Kammer, in die zwei sterilisierten Petrischalen (jeweils etwa 20 ml) gegossen Das geschmolzene Medium bedeckt den Boden der Petrischalen vollständig.

Dann werden die Platten mit ihren Deckeln bedeckt und abkühlen gelassen, um das Medium in ihnen zu verfestigen. Wasserdampf, der an der Innenfläche der Platten und Deckel kondensieren kann, wird verdampft, indem die Platten und Deckel etwa 1 Stunde lang in einem Inkubator bei 37 ° C in umgekehrter Position gehalten werden.

9. Jede Platte ist an der Unterseite in vier Viertel markiert.

10. Die "Spot-Inokulation" der Testbakterien erfolgt aseptisch, vorzugsweise in einer Laminar-Flow-Kammer, in der Mitte jedes Viertels, indem mit Hilfe einer flammsterilisierten Schleife ein Spot (oder ein kleiner Abstrich) der Bakterien erzeugt wird. Die Schlaufe wird nach jeder Impfung sterilisiert.

11. Die inokulierten Platten werden 24 Stunden lang bei 37 ° C in einem Inkubator in umgekehrter Position inkubiert, bis Kolonien der Bakterien sichtbar sind.

12. Die Platten werden mit Oxidase-Reagenz geflutet.

(b) Papiermethode:

1. Ein Whatman-Filterpapierstreifen, der in 1% Oxidase-Reagenz eingetaucht ist, wird getrocknet und im Dunkeln gehalten.

2. Vor dem Gebrauch wird es angefeuchtet und mit Hilfe einer Platindrahtschlaufe als Teststelle eine Schleife der Testbakterien angelegt. Die Nichrom-Schleife kann das Reagenz oxidieren. Daher muss eine Platinschleife verwendet werden.

3. Der Fleck wird nach 10 Sekunden beobachtet.

Beobachtungen:

(a) Plattenmethode:

1. Lila Farbe entwickelt sich auf Bakterienkolonien: Oxidase-positiv.

2. Lila Farbe entwickelt sich nicht auf Kolonien

(Rosa Farbe des Oxidase-Reagens bleibt erhalten): Oxidase-negativ.

(b) Papiermethode:

1. Lila Farbe entwickelt sich vor Ort: Oxidase-positiv.

2. Lila Farbe entwickelt sich nicht sofort: Oxidase-negativ.