Experimentieren Sie, um einen Bakteriophagen zu kultivieren und aufzuzählen

Experimentieren Sie, um einen Bakteriophagen zu kultivieren und aufzuzählen!

Prinzip:

Eine Suspension von Bakterien, die für einen Bakteriophagen (ein Virus, der Bakterien infiziert) anfällig ist, wird mit diesem Bakteriophagen geimpft und als konfluenter Rasen auf einer Agarplatte wachsen gelassen.

Die Bakteriophagenpartikel wachsen in den Bakterienzellen und lysieren sie. Die Lyse der Bakterienzellen führt zur Bildung klarer Zonen im konfluenten Rasen von Bakterien. Diese klaren Zonen werden als Plaques bezeichnet. Es wird angenommen, dass jede klare Zone von einem einzelnen Bakteriophagenpartikel gebildet wird. Die Anzahl der Plaque-bildenden Einheiten (PFUs) repräsentiert somit die Anzahl der Bakteriophagen.

Die Reihenverdünnungstechnik wird bei der Aufzählung von Bakteriophagen ähnlich der bei der Aufzählung von Bakterien verwendeten verwendet. Die Anzahl der in einer Probe enthaltenen Phagenpartikel wird bestimmt, indem die Anzahl der auf der geimpften Agarplatte gebildeten Plaques gezählt und diese mit dem Verdünnungsfaktor multipliziert wird.

Um eine gültige Phagenzahl zu bestimmen, sollte die Anzahl der Plaques pro Platte 300 nicht überschreiten und 30 nicht unterschreiten. Platten mit mehr als 300 PFUs werden als "zu zahlreich" (TNTC) bezeichnet, während Platten mit weniger als 30 PFUs bezeichnet werden 'zu wenige zum zählen' (TFTC).

Erforderliche Materialien:

Trypton-Bouillon, Trypton-Weichagar, Trypton-Hartagar, Erlenmeyerkolben, Reagenzgläser, sterilisierte Petrischalen, Wattestäbchen, Stammkultur des Bakteriophagen (Ex: T 2 coliphage), Nährbouillonkultur der Bakterien (Ex: Escherichia coli B), sterilisierte Pipetten, Autoklav, Heißwasserbad, Bunsenbrenner, Laminar-Flow-Kammer, Entsorgungsglas, Inkubator.

Verfahren:

1. Fünfzehn Pipetten (in einem Edelstahl-Pipettengehäuse) und fünf Petrischalen werden in einem Heißluftofen bei 180 ° C für 3 Stunden sterilisiert. Alternativ können sie mit Kraftpapier abgedeckt, mit Faden oder Gummiband zusammengebunden und zusammen mit den Medien im Autoklaven sterilisiert werden (Abbildung 8.3).

2. Die für 100 ml der Bouillon erforderlichen Bestandteile von Trypton-Bouillon-Medium oder dessen gebrauchsfertigem Pulver werden abgewogen und in 100 ml destilliertem Wasser in einem 250-ml-Erlenmeyerkolben durch Schütteln und Verwirbeln gelöst. Sein pH-Wert wird mit 0, 1 N HCl oder 0, 1 N NaOH nach Bedarf auf 7, 5 eingestellt. Der Kolben wird gegebenenfalls erhitzt, um die Bestandteile vollständig aufzulösen.

3. Die Brühe wird in 10 Reagenzgläser (je 9 ml) verteilt, mit Watte verstopft, mit Bastelpapier bedeckt und mit Faden oder Gummiband zusammengebunden.

4. Die für 100 ml des Mediums erforderlichen Bestandteile von Trypton-Weichagarmedium oder dessen Fertigpulver werden abgewogen und in 100 ml destilliertem Wasser in einem 250-ml-Erlenmeyerkolben durch Schütteln und Verwirbeln gelöst. Sein pH-Wert wird mit 0, 1 N HCl oder 0, 1 N NaOH nach Bedarf auf 7, 5 eingestellt. Der Kolben wird erhitzt, um den Agar vollständig in dem Medium aufzulösen.

5. Dieses flüssige Medium wird in 5 Reagenzgläser (je 2 ml) verteilt, mit Watte verstopft, mit Bastelpapier bedeckt und mit Faden oder Gummiband zusammengebunden.

6. Die für 100 ml des Mediums erforderlichen Bestandteile des Trypton-Hartagarmediums oder seines gebrauchsfertigen Pulvers werden abgewogen und in 100 ml destilliertem Wasser in einem 250-ml-Erlenmeyerkolben durch Erwärmen nach pH-Einstellung auf 7, 5 gelöst. Der Kolben ist mit Baumwolle verstopft, mit Bastelpapier bedeckt und mit Faden oder Gummiband gebunden.

7. Die 10 Trypton-Bouillon-Röhrchen, die 5 Trypton-Weichagar-Röhrchen und der Kolben, der Trypton-Hartagarmedium enthält, werden bei 121 ° C (15 psi Druck) 15 Minuten in einem Autoklaven sterilisiert.

8. Das sterilisierte Trypton-Hartagarmedium im Erlenmeyerkolben wird aseptisch in 5 sterilisierte Petrischalen gegossen, um 5 Trypton-Hartagarplatten zu erhalten.

9. Ein ml der Stammkultur des Bakteriophagen (Ex: T 2 coliphage) wird aseptisch, vorzugsweise in einer Laminar-Flow-Kammer, unter Verwendung einer sterilisierten Pipette in ein Trypton-Bouillon-Röhrchen (9 ml) transferiert. Dies ist die 10-fache Verdünnung (dh 10 -1 ). Dies wird seriell aseptisch in den anderen neun Bouillonröhrchen verdünnt, um eine Endverdünnung von 10 -10 zu erhalten (Abbildung 8.4).

10. Die 5 sterilisierten Trypton-Weichagar-Röhrchen werden entnommen und in einem Wasserbad auf 100 ° C erhitzt, um den Agar zu schmelzen. Die Röhrchen werden gekühlt und die geschmolzenen weichen Röhrchen bei 45 ° C gehalten.

11. Unter den obigen 10 Röhrchen, die Phagen mit unterschiedlichen Konzentrationen enthalten, werden fünf Röhrchen (dh 10 -5, 10 -6, 10 -7, 10 -8 und 10 -9 ) ausgewählt. Aus diesen Röhrchen wird aseptisch jeweils 1 ml mit separaten sterilisierten Pipetten in die fünf Trypton-Agar-Agar-Röhrchen überführt.

12. Zwei Tropfen Nährbouillonkultur der Bakterien (Ex: Escherichia coli B) werden aseptisch, vorzugsweise in einer Laminar-Flow-Kammer, in jedes Trypton-Soft-Agar-Röhrchen übertragen, das den Bakteriophagen in fünf verschiedenen Konzentrationen (10 -5 bis 10 -9) enthält ).

13. Der Inhalt der fünf Trypton-Weichagar-Röhrchen, die den Bakteriophagen und die Bakterien enthalten, wird durch Rotation zwischen den Handflächen schnell gemischt.

Der Inhalt wird aseptisch über die fünf mit 10 -5 bis 10 -9 gekennzeichneten Trypton-Hartagarplatten gegossen, wodurch eine Doppelschicht-Plattenkulturpräparation gebildet wird. Die Platten werden sanft gewirbelt und aushärten gelassen.

15. Die Platten werden in invertierter Position bei 37 ° C in einem Inkubator inkubiert.

Beobachtungen:

1. Alle Platten werden für Plaque bildende Einheiten (PFUs) beobachtet, die sich als klare Zonen auf dem Rasen von Bakterien entwickeln.

2. Nur Platten mit PFUs zwischen 30 und 300 werden für die Zählung von Phagen in Betracht gezogen. Die Anzahl der PFUs auf jeder Platte wird gezählt. Platten mit mehr als 300 PFUs werden als "zu zahlreich zum Zählen" (TNTC) bezeichnet, während Platten mit weniger als 30 PFUs als "zu wenige zum Zählen" (TFTC) bezeichnet werden. Solche Platten werden nicht berücksichtigt.

3. Basierend auf den Beobachtungen wird die Anzahl der Bakteriophagen pro ml der Stammphagenkultur unter Verwendung der folgenden Formel berechnet.

Anzahl Phagen / ml = Anzahl PFUs X Verdünnungsfaktor

Wenn beispielsweise die Anzahl der PFUs bei einer Verdünnung von 10 -7 280 beträgt, dann beträgt die Anzahl der Phagen in der Stammkultur des Phagen 280 × 10 7 Phagen / ml (= 2, 80 × 10 9 Phagen / ml).