In einer Probe vorhandene Bakterien durch serielles Verdünnungsagar-Plattierungsverfahren oder Total Plate Count (TPC) -Verfahren

Gesamtzahl der Platten (TPC):

In einer Probe vorhandene Bakterien durch serielles Verdünnungsagar-Plattierungsverfahren oder Total Plate Count (TPC) -Verfahren aufzählen.

Zweck:

Das Ausmaß der bakteriellen Aktivität in einer bestimmten Probe unter bestimmten Bedingungen hängt hauptsächlich von der Gesamtzahl der darin enthaltenen Bakterien ab, unabhängig von ihrer Spezies.

Daher ist es häufig erforderlich, die Gesamtzahl der in Proben von Lebensmitteln, Wasser, Boden, Luft und Gewebe enthaltenen Bakterien während ihrer mikrobiologischen Analyse zu ermitteln. Diese Gesamtzahl an Bakterien umfasst sowohl lebende als auch tote Bakterien. ' Tote Bakterien können nicht wachsen und sich vermehren.

Nur lebende Bakterien (lebensfähige Bakterien) können wachsen und sich vermehren, was zu spezifischer bakterieller Aktivität führt. Daher ist es häufig erforderlich, die lebensfähigen Bakterienzellen in verschiedenen Proben aufzulisten. Die meisten Aufzählungsverfahren wie direkte Mikroskopie, elektronische Zellzahl, chemische Verfahren und spektrophotometrische Verfahren zählen jedoch sowohl lebende als auch tote Zellen.

Diese Methoden können nicht zwischen lebenden und toten Zellen unterscheiden. Daher ist das serielle Verdünnungsagar-Plattierungsverfahren, das nur die lebensfähigen Bakterienzellen zählt, das universell verwendete Verfahren zum Zählen lebender lebensfähiger Zellen in verschiedenen Proben.

Prinzip:

Ein bestimmtes Gewicht der festen Probe wird aseptisch in neun Volumina steriler Salzlösung homogenisiert, um eine homogene Bakteriensuspension zu erhalten. Die flüssige Probe wird direkt als homogene Bakteriensuspension verwendet. Die so erhaltenen Suspensionen von Bakterien werden seriell verdünnt (10-fach, 100-fach, 1000-fach usw.). Hier werden 10 -1, 10 -2, 10 -3 usw. Verdünnungen genannt.

Ihre Kehrwerte (10 1, 10 2, 10 3 usw.) werden als Verdünnungsfaktoren bezeichnet. Ein bestimmtes Volumen der Bakteriensuspension aus jeder Verdünnung wird auf Agarplatten geimpft und richtig verteilt, um die einzelnen Bakterienzellen weit voneinander zu trennen und voneinander zu isolieren.

Die Inokulation von Bakterien zur Aufzählung erfolgt in zwei Techniken:

1. Plattentechnik gießen

2. Spread-Plate-Technik

1. Pour Plate-Technik:

Bei dieser Technik wird 1 ml der Bakteriensuspension auf eine sterilisierte Petrischale getropft und anschließend mit flüssigem Nähragarmedium übergossen. Die Petrischale wird sanft gewirbelt, damit sich die Suspension gleichmäßig mit dem Medium vermischen kann. Es darf abkühlen und erstarren.

2. Spread Plate Technik:

Bei dieser Technik werden 0, 1 ml der Bakteriensuspension auf eine vorbereitete Agarplatte getropft. Dann wird der Suspensionstropfen mit einem sterilisierten Glasverteiler gleichmäßig auf der Agarplatte verteilt.

Um den Fehler zu minimieren, wird jede verdünnte Suspension auf 2-5 Replikatplatten ausplattiert. Die beimpften Platten werden 24 Stunden bei 37 ° C inkubiert. Während dieser Zeit wächst und vermehrt sich jede einzelne einzelne Bakterienzelle auf der Agarplatte schnell, um eine makroskopische sichtbare Masse von Bakterienzellen zu erzeugen, die als "Kolonie" bezeichnet wird. Somit stellt die Anzahl der Kolonien auf der Platte die Anzahl der Bakterien in der Probe dar.

Sehr häufig können sich jedoch während des Ausbreitens einige Zellen nicht richtig trennen, und wenige solcher nicht separierten Zellen können zu einer einzelnen Kolonie führen. Außerdem neigen nur wenige Zellen dazu, in Paaren, Ketten oder Clustern zu bleiben.

Hier erzeugt jedes Paar, jede Kette oder jedes Cluster eine Kolonie. Somit stellt jede Kolonie im engeren Sinne kein einzelnes Bakterium dar. Deshalb, anstatt die Anzahl der Bakterien als "Nein" auszudrücken. von Bakterien / g oder ml Probe 'wird dies sehr oft als Anzahl koloniebildender Einheiten pro g oder ml (CFU / g oder ml) ausgedrückt.

Die Gesamtzahl der Platten (TPC) in der ursprünglichen Probe wird berechnet, indem die Anzahl der CPUs mit den jeweiligen Verdünnungsfaktoren multipliziert wird. Die Aufzählungsregeln werden befolgt, während die Anzahl der Bakterien in der ursprünglichen Probe berechnet wird.

Erforderliche Materialien:

Petrischalen (15 Teile), 2 ml Pipetten (10 Teile), 10 ml Pipette (1 Stück), Reagenzgläser (10 Teile), Erlenmeyerkolben (jeweils 500 ml und 1 Liter-1), 500 ml Becherglas (2 Teile), Glasverteiler, Pipettengehäuse aus Edelstahl, Kraftpapier, Faden (oder Gummiband), nicht saugfähige Baumwolle, Ethylalkohol, Natriumchlorid (NaCl), 0, 1 N Salzsäure (HCl), 0, 1 N Natriumhydroxid (NaOH), destilliertes Wasser, Nähragar, flüssige Probe (z. B. Teichwasser / Abwasser), feste Probe (z. B. Boden / Fischfleisch / Austernfleisch / verarbeitete Lebensmittel), pH-Papier (oder pH-Meter), Pistill und Mörtel (oder Homogenisator), Bunsenbrenner, Heißluftofen, Autoklav, Inkubator, Laminar-Flow-Kammer, Quebec-Kolonienzähler.

Verfahren:

1. Zehn Pipetten (in einem Edelstahlpipettengehäuse), 15 Petrischalen und ein Paar Pistill und Mörser (oder ein Homogenisierbecher) werden in einem Heißluftofen bei 180 ° C für 3 Stunden sterilisiert. Alternativ können sie mit Kraftpapier abgedeckt, mit Faden oder Gummiband gebunden und zusammen mit dem Medium im Autoklaven sterilisiert werden (Abbildung 6.6).

Die Anzahl der Petrischalen und dementsprechend die Menge des zu verwendenden Mediums wird in Abhängigkeit von der Anzahl der erforderlichen Wiederholungen und Verdünnungen berechnet. Hier wurden die Glaswaren und das Medium zur einmaligen Replikation und Verdünnung auf 10 -6 genommen . Die Anzahl der Glaswaren und die Menge an zur Sterilisation entnommenem Medium ist etwas höher, um zufällige Fehler zu vermeiden, da die Sterilisation ein langwieriger Prozess ist.

2. 4, 25 g NaCl werden in 500 ml destilliertem Wasser gelöst, um physiologische Kochsalzlösung (0, 85%) zu erhalten. 225 ml dieser Salzlösung werden in einen 500 ml Erlenmeyerkolben gegossen. Das Maul ist mit Baumwolle verstopft, mit Bastelpapier bedeckt und mit Faden oder Gummiband gebunden. Es wird als erstes Verdünnungsmittel verwendet, um die feste Probe zu verdünnen.

3. In jedes der 10 Reagenzgläser werden auch 9, 0 ml der restlichen Salzlösung pipettiert. Ihre Münder sind mit Baumwolle verstopft, mit Bastelpapier bedeckt und mit Faden oder Gummiband gebunden. Diese werden als Verdünnungsmittel für die Reihenverdünnung verwendet.

4. Die für 500 ml des Mediums erforderlichen Bestandteile des Nähragarmediums oder seines gebrauchsfertigen Pulvers werden abgewogen und in 500 ml destilliertem Wasser in einem 1-Liter-Erlenmeyerkolben durch Schütteln und Verwirbeln gelöst.

Sein pH-Wert wird unter Verwendung eines pH-Papiers oder eines pH-Meters bestimmt und mit 0, 1 N HCl auf 0, 1 eingestellt, wenn weniger oder weniger mit 0, 1 N NaOH. Der Kolben wird erhitzt, um den Agar vollständig in dem Medium aufzulösen. Dann wird es mit Baumwolle verstopft, mit Bastelpapier bedeckt und mit Faden oder Gummiband gebunden.

5. Der 500-ml-Erlenmeyerkolben mit 225 ml Kochsalzlösung, die 10 Reagenzgläser mit je 9 ml Kochsalzlösung und der 1-Liter-Erlenmeyerkolben mit 500 ml Nähragar-Medium werden bei 121 ° C (15 psi Druck) 15 Minuten lang sterilisiert in einem Autoklaven.

6. Nach der Sterilisation werden die sterilisierten Materialien aus dem Autoklaven entnommen und einige Zeit abkühlen gelassen, ohne dass sich das Medium verfestigt. Die Kühlung des Mediums verhindert die Kondensation und Ansammlung von Wassertropfen in den Platten. Wenn das Medium bereits während der Lagerung hergestellt und verfestigt wurde, muss es durch vorsichtiges Erhitzen verflüssigt werden, bis es vollständig schmilzt.

7. Um Agarplatten herzustellen, bevor das sterilisierte Nähragarmedium in warmem geschmolzenem Zustand abkühlt und sich verfestigt, wird es aseptisch in die 6 sterilisierten Petrischalen (je etwa 20 ml) gegossen, so dass das geschmolzene Medium den Boden des Petri bedeckt Geschirr komplett.

Dann werden die Platten mit ihren Deckeln bedeckt und abkühlen gelassen, um das Medium in ihnen zu verfestigen. Wasserdampf, der an der Innenfläche der Platten und Deckel kondensieren kann, wird verdampft, indem die Platten und Deckel etwa 1 Stunde lang in einem Inkubator bei 37 ° C in umgekehrter Position gehalten werden.

8. 25 g der festen Probe (z. B. Fischfleisch / Austernfleisch / verarbeitete Lebensmittel) werden gewogen und in 225 ml sterilisierter Salzlösung (Verdünnungsmittel) aseptisch homogenisiert (Abbildung 6.7). Dies ergibt eine 10fache Verdünnung (Verdünnung = 10 -1 ). Für die flüssige Probe wird 1 ml Probe aseptisch in ein sterilisiertes 9-ml-Salzröhrchen pipettiert. Dies ergibt auch eine 10-fache Verdünnung (Verdünnung = 10 -1 ).

9. 1 ml der 10 -1- Verdünnung wird in einem weiteren Reagenzglas in 9 ml sterilisierte Salzlösung überführt. Dies ergibt eine 100-fache Verdünnung (Verdünnung = 10 -2 ). Aus der 10 -2- Verdünnung wird 1 ml in eine sterilisierte Petrischale und 0, 1 ml auf eine Agarplatte aus derselben Pipette getropft. Für jede Verdünnung wird eine separate sterilisierte Pipette verwendet. Nach Gebrauch wird es in den Entsorgungsbehälter getaucht.

10. 1 ml der 10 -2- Verdünnung wird in einem weiteren Reagenzglas in 9 ml sterilisierte Salzlösung überführt. Dies ergibt eine 1000fache Verdünnung (Verdünnung = 10 & supmin ; ³ ). Aus der 10 -3- Verdünnung wird 1 ml in eine sterilisierte Petrischale und 0, 1 ml auf eine Agarplatte aus derselben Pipette getropft. Auf ähnliche Weise wird die Verdünnung seriell bis zu 10 -6 fortgesetzt, wobei jedes Mal 1 ml in eine sterilisierte Petrischale und 0, 1 ml auf eine Agarplatte aus derselben Pipette überführt werden.

11. Dann werden die Suspensionstropfen auf den Agarplatten durch einen sterilisierten Glasverteiler aseptisch verteilt. Nach dem Verteilen in jeder Platte wird es durch Eintauchen in Alkohol und Anzeige über einer Flamme flammensterilisiert. Dies ist die "Spread Plate-Technik".

12. Die Petrischalen mit jeweils 1 ml Bakteriensuspension werden entnommen und mit sterilisiertem, verflüssigtem Nähragar gefüllt. Sie werden sanft gewirbelt, damit sich die Suspension gleichmäßig mit dem Medium vermischen kann. Man lässt die Platten abkühlen, bis sich das Medium verfestigt. Dies ist "Gießplattentechnik".

13. Anschließend werden die Platten in umgekehrter Position 24 Stunden bei 37 ° C in einem Inkubator inkubiert (Abbildung 6.7).

14. Eine nicht inokulierte Agarplatte wird zur Kontrolle inkubiert, um eine ordnungsgemäße Sterilisation sicherzustellen, wie durch kein Wachstum darauf angezeigt wird.

Beobachtungen:

Die Anzahl der Bakterienkolonien auf den Platten wird direkt oder mit Hilfe eines Québec-Kolonienzählers gezählt. Daraus wird die Anzahl der Bakterien pro Gramm oder ml der ursprünglichen Probe berechnet. Dies wird als Aufzählung bezeichnet.

Aufzählungsregeln:

1. Petrischalen mit 30 bis 300 Kolonien sollten in Betracht gezogen werden.

2. Die durchschnittliche Anzahl von Duplikaten und Triplikaten (R 1, R 2 R 3 …) wird nur berücksichtigt, wenn eine Zählung nicht mehr als das Doppelte der anderen ist. Wenn einer mehr als doppelt so groß ist, wird der niedrigere Wert genommen.

3. Für die Pour Plate-Technik ist die Keimzahl Nr. X 10 c / g, wobei c = Verdünnungsfaktor ist. Für die Technik der Ausbreitungsplatten ist die Keimzahl Nr. X10 c + 1 / gm, wobei c der Verdünnungsfaktor ist. Die Zahl wird in Form von (x.yz X 10 m ) in zwei Dezimalstellen umgewandelt. Zum Beispiel wird 288 × 10 4 als 2, 88 × 10 6 ausgedrückt.

4. Wenn in allen Verdünnungen die Kolonienzahl mehr als 300 ist, gilt die höchste Verdünnung, und ist sie in allen Verdünnungen kleiner als 30, wird die niedrigste Verdünnung berücksichtigt. In beiden Fällen wird die Zählung dargestellt als: geschätzte Nr. X 10 c / g oder ml für die Gießplattentechnik und geschätzte Nr. X 10 c + 1 / g oder ml für die Ausbreitungsplattentechnik.

5. Wenn bei einer Verdünnung keine Kolonie beobachtet wird, wird sie wie folgt dargestellt: Geschätzt <1 x niedrigste Verdünnung.

6. Da die Reihenverdünnung 10-fach erfolgt, ist es mathematisch offensichtlich, dass keine zwei Verdünnungen Kolonien zwischen 30 und 300 haben können. Wenn 10 –3 50 Kolonien haben, sollte 10 –2 500 haben (dh> 300) und 10 -4 sollten 5 (dh <30) Kolonien haben.

Dies ist jedoch in der Realität nicht der Fall, da Bakterien nicht als homogene Lösung auftreten. es kommt eher als Suspension in den Verdünnungsmitteln vor. Wenn es zwei Verdünnungen mit zählbaren Kolonien (zwischen 30 und 300) gibt, berechnen Sie zuerst die Anzahl der koloniebildenden Einheiten / g oder ml unter Verwendung jeder Verdünnung.

Wenn ein Wert mehr als doppelt so groß ist wie der andere, geben Sie den niedrigeren Wert an. Wenn nicht, nehmen Sie den Durchschnitt der beiden Werte und melden Sie diesen Wert.